苦碟子注射液预处理对急性缺血性脑卒中后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证模型大鼠神经功能及海马神经元的影响研究

马瑞雪，张綦慧

急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）是一种由于各种原因突然引起脑内血液供应障碍，最终导致脑组织出现缺血缺氧坏死并迅速影响神经功能的脑血管疾病［1］。《中国脑卒中防治报告2019》指出，近年我国急性脑卒中的发生率呈暴发式上升，是造成我国成年人残疾、死亡的首要疾病［2］。AIS患者常属于血瘀毒损证，而苦碟子注射液是治疗该证的代表药物之一，其具有活血止痛、清热化瘀的功效［3］。患者发生AIS后无论是否及时实现血管再通，其脑功能均会受到一定损伤，即脑缺血再灌注损伤，而苦碟子注射液可以对脑缺血再灌注损伤起到一定保护作用［4-5］，具有极高的临床意义。本研究通过构建AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证模型大鼠，观察苦碟子注射液预处理对其神经功能及海马神经元的影响，以期揭示苦碟子注射液预处理治疗AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证的最佳起效时间。

1 材料与方法

1.1 实验时间 本实验时间为2020年10月至2021年2月。

1.2 实验动物 64只SPF级成年雄性Wistar大鼠〔实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006〕由北京维通利华公司提供，体质量230～250 g，适应性饲养3 d，饲养条件严格按照北京中医药大学东方医院SPF级实验动物中心标准执行，饲养温度21～25 ℃，湿度40%～70%，自由摄食饮水。本研究已获得北京中医药大学东方医院动物伦理委员会批准（202016）。实验过程中对实验动物的处理符合实验动物3R原则。

1.3 主要药物及试剂 苦碟子注射液（购自通化华夏药业有限公司，国药准字Z20025450，规格：10 ml×10支），多聚甲醛溶液（购自北京索莱宝科技有限公司，P1110-500），戊二醛溶液（购自北京索莱宝科技有限公司，P1126-100），角叉菜胶（购自上海源叶生物科技有限公司，S30559-100），大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）线栓（购自北京西浓科技有限公司，2634A4，规格：0.34 mm）。

1.4 主要仪器 4 ℃低温冰箱（购自青岛海尔冰箱股份有限公司，HXC-106），超薄切片机（购自德国LEICA公司，UC7），光学显微镜（购自德国LEICA公司，DP72-SET），透射电镜（购自日本Hitachi公司，H-7650）。

1.5 实验方法

1.5.1 实验分组及干预措施 采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组和治疗组，每组18只，余10只备用。治疗组构建AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证模型，术前7 d开始腹腔注射苦碟子注射液8.4 g•kg-1•d-1至手术当天，术前腹腔注射角叉菜胶3 d至术前24 h，1次/d。模型组构建AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证模型，术前7 d开始腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液至手术当天，术前腹腔注射角叉菜胶3 d至术前24 h，1次/d。假手术组不构建AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证模型，只给予术前麻醉，分离颈部血管，不结扎和插入MCAO线栓。

1.5.2 AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证模型构建方法 通过腹腔注射角叉菜胶制备血瘀毒损证模型［6］：采用0.9%氯化钠溶液将角叉菜胶配成4%的浓度，治疗组、模型组大鼠以20 mg/kg腹腔注射，1次/d，连续3 d。以爪甲肿胀红紫、出现黑尾现象、体温呈增高趋势为血瘀毒损证模型构建成功。末次注射角叉菜胶后正常饲养24 h，参照Longa改良法［7］构建MCAO模型，即AIS后脑缺血再灌注损伤模型：术前12 h禁食不禁水。采用10%水合氯醛溶液以400 mg/kg腹腔注射来麻醉大鼠，大鼠仰卧位固定、消毒、备皮，沿颈部正中线切开皮肤，逐层钝性分离颈部肌肉组织，充分暴露并分离左侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA），置线备用。用动脉夹夹闭CCA、ICA，结扎ECA近心端及远心端，中间剪断。将ECA游离端拉至与ICA成一条直线，由ECA插入MCAO线栓，打开ICA处动脉夹，将MCAO线栓插入ICA并继续插入颅内至微感阻力，插入深度为（18.5±0.5）mm，使MCAO线栓头端通过大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）起始处，以阻塞左侧MCA的血液供应，结扎ICA以固定MCAO线栓和防止出血，打开CCA处动脉夹，逐层缝合，留1 cm MCAO线栓残端于皮外。术后1 h拔出MCAO栓线以再灌注。采用Zea Longa评分评估大鼠神经功能缺损情况，1～4分为造模成功，由于神经功能缺损评分为4分的大鼠脑缺血再灌注损伤较重，故选择神经功能缺损评分为1～3分的大鼠进行后续取材。将实验过程中未达到取材时间而死亡的大鼠剔除（共8只），并进行补充造模，其中模型组补充造模5只，治疗组补充造模3只。

1.6 观察指标

1.6.1 症状、体征 观察各组大鼠整个实验过程中的症状、体征，包括皮毛颜色、爪甲颜色、精神状态、行为能力。

1.6.2 Zea Longa评分 分别于造模后1、3、6、24、72 h及7 d选取各组大鼠4只，评估其Zea Longa评分以观察其神经功能缺损情况。0分：无神经功能缺损症状；1分：存在轻度神经功能缺损，对侧前肢不能完全伸展；2分：存在中度神经功能缺损，行走时向对侧转圈；3分：存在严重神经功能不全，走路时向对侧倾倒；4分：意识丧失，无法自发行走。Zea Longa评分越高表示大鼠神经功能缺损越严重。

1.6.3 海马神经元形态及超微结构 分别于造模后1、3、6、24、72 h及7 d选取各组大鼠3只，采用10%水合氯醛以400 mg/kg腹腔注射来麻醉大鼠，剪开胸腹腔，暴露心脏，用9#针头穿刺左心室至主动脉，用止血钳夹闭固定针头，剪开右心耳，用37 ℃、0.9%氯化钠溶液200 ml+12 500 U肝素钠快速灌洗全身血液至右心耳流出无色透明液体，再用4%多聚甲醛溶液缓慢灌洗及固定脑组织和身体，待大鼠僵硬后，迅速断头取脑。取出大脑后在冰上分离出患侧海马区，将其切成1 mm3，置于2.5%戊二醛溶液中2 h，置于磷酸盐缓冲液中10 min，每隔10 min更换磷酸盐缓冲液1次，连续更换2次后置于4 ℃低温冰箱中保存备用。取出样本后用1%锇酸固定2 h，梯度乙醇脱水，丙酮置换，经Epon812环氧树脂包埋、体视显微镜下修块、天青-美蓝染色后，于光学显微镜下定位，采用超薄切片机切片（厚度为50～60 nm），进行醋酸铀和柠檬酸铅双重电子染色，置于透射电镜下观察切片上海马神经元形态及超微结构。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 症状、体征 假手术组大鼠毛发富有色泽，活动灵活，四肢对称，正常进食；模型组大鼠随着造模时间的延长，逐渐出现皮毛粗糙发黄，呈倒立针刺状，爪甲肿胀，鼠尾黑紫甚至出现断尾，易激惹，活动受限，轻者右侧肢体伸展不全，中重度者活动转圈或向右侧倾倒，以造模后24、72 h时最为明显；治疗组大鼠皮毛无光泽，爪甲肿胀及黑尾、断尾程度较模型组减轻，活动轻微受限，四肢稍显不对称，但仍差于假手术组。

2.2 Zea Longa评分 假手术组大鼠Zea Longa评分均为0分。模型组和治疗组大鼠造模后1、3、6 h Zea Longa评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗组大鼠造模后24 h、72 h、7 d Zea Longa评分低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组大鼠造模后24 h、72 h、7 d Zea Longa评分高于本组造模后1 h，造模后72 h、7 d Zea Longa评分高于本组造模后3、6 h，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组大鼠造模后7 d Zea Longa评分高于本组造模后1 h，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠不同时间点Zea Longa评分比较（±s，分，n=4）Table 1 Comparison of Zea Longa score in each group at different time points

表1 各组大鼠不同时间点Zea Longa评分比较（±s，分，n=4）Table 1 Comparison of Zea Longa score in each group at different time points

注：a表示与本组造模后1 h比较，P＜0.05；b表示与本组造模后3 h比较，P＜0.05；c表示与本组造模后6 h比较，P＜0.05

组别 造模后1 h 造模后3 h 造模后6 h 造模后24 h 造模后72 h 造模后7 d模型组 1.50±0.58 2.00±0.82 2.25±0.50 2.75±0.50a 3.25±0.50abc 3.25±0.50abc治疗组 1.25±0.50 1.50±0.58 1.75±0.50 1.50±0.58 2.00±0.82 2.25±0.50a t值 0.655 1.000 1.414 3.273 2.611 2.828 P值 0.537 0.356 0.207 0.017 0.040 0.030

2.3 海马神经元形态及超微结构 假手术组大鼠海马神经元结构完整，细胞核大而圆，核膜清晰，呈双层结构，可见核孔，核液中常染色质均匀分布，异染色质少，电子密度较低，胞质中可见丰富、结构完整的细胞器，核糖体广泛分布，见图1A。

模型组大鼠造模后6 h海马神经元体积缩小，核膜皱缩，异染色质增多，随着时间的延长，异染色质逐渐汇聚成块并聚集在核膜周围，线粒体结构松散，粗面内质网囊性变、脱颗粒、断裂，游离核糖体减少，溶酶体结构完整；造模后24、72 h可见细胞核破碎，核膜不完整甚至消失，细胞器大量减少，线粒体肿胀、嵴断裂，甚至出现空泡、脱颗粒状态，高尔基体和粗面内质网囊性扩张、肿胀，脂褐素增加；造模后7 d可见神经元大量减少，形态不规则，细胞器结构破坏严重，线粒体呈空泡状态，见图1B～1G。

治疗组大鼠造模后6 h海马神经元与模型组相比细胞膜完整，常染色质均匀，电子密度较低，细胞器增多，细胞器结构轻度改变，空泡明显减少；造模后72 h可见细胞核深染，线粒体肿胀程度减轻，嵴结构存在，高尔基体、粗面内质网形态较好，空泡减少甚至消失，各细胞器结构状态明显好于同期模型组，见图1H～1M。

图1 各组大鼠患侧海马神经元形态及超微结构（×1 500）Figure 1 Morphology and ultrastructure of hippocampal neurons on the affected side of rats in each group

3 讨论

AIS属于中医学中的“中风”范畴，临床患者以面色晦暗、肌肤甲错、痰黄、脉疾、舌红、苔黄腻等中医四诊信息较为常见［8］。成年人首次发病后，随着时间的推移，1年内脑卒中复发率高达14.7%，近年来脑卒中发病率和死亡率也逐年增长［2］。张锦等［9］、王永炎［10］指出，“毒损脑络”是AIS的基本病机，中风后血瘀、火热、痰湿等病理产物与毒邪交织相夹、郁积日久形成瘀毒、火毒、痰毒，共同侵袭、损伤脑络，是中风病程发展、病情转变的重要结点。随着发病时间的延长，脑络损伤加重，会引起一系列神经功能缺损症状，包括认知障碍，而海马是学习、记忆等神经功能的映射区域，是易受脑缺血后损伤累及的脑区，AIS发生后可导致海马变形［11］。线粒体能够为细胞供能，对损伤极为敏感，其肿胀程度可以反映神经元的损伤程度，因此通过观察海马神经元形态及超微结构的变化研究保护海马神经元对抑制AIS后脑缺血再灌注损伤具有重要作用。张伯礼等［12］研究表明，苦碟子注射液能够降低中风的致残率、病死率，提高患者的生存质量。亦有Meta分析发现，苦碟子注射液的临床治疗有效率优于其他常规用药［13］。但苦碟子注射液治疗AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证的最佳起效时间点尚未见报道，本研究构建AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证模型大鼠，观察苦碟子注射液预处理对其神经功能及海马神经元的影响。

本研究结果显示，假手术组大鼠活动灵活，四肢对称；模型组大鼠随着造模时间的延长，逐渐出现爪甲肿胀，鼠尾黑紫甚至出现断尾，易激惹，活动受限；治疗组大鼠爪甲肿胀及黑尾、断尾程度较模型组减轻，活动轻微受限，四肢稍显不对称；提示苦碟子注射液预处理能够减轻AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证模型大鼠的缺血性损伤表现。治疗组大鼠造模后24 h、72 h、7 d Zea Longa评分低于模型组；模型组大鼠造模后24 h、72 h、7 d Zea Longa评分高于本组造模后1 h，造模后72 h、7 d Zea Longa评分高于本组造模后3、6 h；治疗组大鼠造模后7 d Zea Longa评分高于本组造模后1 h；从行为学角度证实了苦碟子注射液预处理能够改善AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证模型大鼠的神经功能，且其最佳起效时间可能为24、72 h。模型组大鼠造模后6 h海马神经元体积缩小；造模后24、72 h可见细胞核破碎，细胞器大量减少，线粒体肿胀，高尔基体和粗面内质网囊性扩张、肿胀；造模后7 d可见神经元大量减少，形态不规则，细胞器结构破坏严重，线粒体呈空泡状态。治疗组大鼠造模后6 h海马神经元与模型组相比细胞器增多，细胞器结构轻度改变；造模后72 h可见线粒体肿胀程度减轻，高尔基体、粗面内质网形态较好，空泡减少甚至消失，各细胞器结构状态明显好于同期模型组。提示模型组和治疗组大鼠海马神经元较假手术组出现不同程度的损伤，从形态学角度证实苦碟子注射液预处理能够在一定程度上改善AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证模型大鼠的海马神经元损伤情况，且其最佳起效时间为6～72 h。而从行为学与形态学角度确定的苦碟子注射液预处理的最佳起效时间存在差异，可能与海马相较躯体症状而言对神经功能缺损更加敏感有关。现代药理研究表明，苦碟子注射液可增加纤溶酶活性、抑制血栓形成、增加脑血流量［14］；而既往研究表明，脑缺血再灌注损伤过程中神经环路信息传递出现障碍［15-17］。本研究结果在与既往动物实验结果［18］一致的基础上，以优先保护组织形态学改变为原则，进一步明确了造模后6～72 h可能为改善神经功能缺损的最佳时间点，推测可能与某种神经传导信号通路有关。

本研究尚存在一定局限性：本研究样本量较小，结果可能存在偏倚，需进一步扩大样本量加以验证；此外，本研究虽明确了苦碟子注射液预处理能早期抑制脑缺血级联反应损伤并有效减轻脑损伤、维持神经元的形态与功能，但仍未确定苦碟子注射液预处理治疗AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证模型大鼠的具体作用靶点，这也是未来的研究方向。

综上所述，苦碟子注射液预处理可以减轻AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证模型大鼠的神经功能缺损情况，抑制大鼠患侧海马神经元形态及超微结构的改变，对脑组织具有一定的保护作用，且在造模后6～72 h的作用最明显，为临床上使用苦碟子注射液治疗AIS后脑缺血再灌注损伤血瘀毒损证患者提供了一定的实验依据和临床切入点。

作者贡献：马瑞雪、张綦慧进行研究方案设计与可行性分析；马瑞雪进行动物实验、数据收集、整理和分析，撰写与修订论文；张綦慧进行质量控制与审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。