氟咯草酮液相色谱质谱分析方法构建

李宗兴，李 玮

(1.青海大学农牧学院，青海 西宁 810016；2.青海大学农林科学院，青海 西宁 810016;3.青海省农业有害生物综合治理重点实验室，青海 西宁 810016)

氟咯草酮(Flurochloridone,FLC)是一种吡咯烷酮类除草剂，分子式为C12H10Cl2F3NO。它对繁缕、婆婆纳、马齿苋、猪殃殃等阔叶类杂草中的胡萝卜素、叶绿素合成有很大影响，从而达到除草的效果，多在播后苗前施用，对作物安全，在国内外具有广泛的应用前景[1-3]。

马铃薯作为我国第四大粮食作物，是我国主要的增量作物之一，它作为一种耐寒作物，具有适应性广、抗旱性强等特征[4-5]。农田中杂草过多生长会影响马铃薯的产量和品质，青海高原地区主要还是以化学除草为主，当前马铃薯田间国家登记生产的除草剂种类有二甲戊灵、乙草胺、精喹禾灵、异丙草胺等[6]。马铃薯田间的除草剂还是以氟乐灵等传统除草剂为主，随着杂草种类和密度的增加，传统除草剂不能起到很好的防除效果，而且用量大，造成农药残留，对环境也造成污染，需要一种新型除草剂来改变这种现状。王恒智[7]等研究了氟咯草酮及其混剂在棉花田间的防治效果及安全性，但是氟咯草酮在马铃薯田间的防治效果及安全性少有报道，因此氟咯草酮被课题组应用于青海高原马铃薯田间的防治效果和安全性研究[8]。结果表明：氟咯草酮在马铃薯田使用中的剂量推荐为350-650g a.i./hm2；对单双子叶杂草综合防效达到80%以上，增产10.15%以上，而且对马铃薯的营养价值和品值无影响。目前有报道研究了氟咯草酮的分析检测方法[9]，但氟咯草酮在马铃薯田间基质中的分析检测方法较少。本文主要为氟咯草酮在青海高原马铃薯田间试验构建残留检测方法，该方法采用改进的QuEChERs前处理净化法和液相色谱串联质谱法联用进行检测，与单一的色谱法相比，色谱质谱串联法具有灵敏度高、高度专一等特点，成为一种农药残留检测的重要手段；QuChERs法具有快速、简单、廉价、高效、安全、对环境友好等特点，广泛运用于农药残留检测中样品前处理与净化过程[10-11]。两种方法的联用对马铃薯田中氟咯草酮残留的检测提供了更加快捷、简单的技术支持，建立了马铃薯和土壤中氟咯草酮残留的定量分析方法。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与材料

色谱甲醇、乙腈( 天津白石化工有限公司)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18固相分散剂、0.22μm有机滤膜(Agela Technologies,天津)；无水硫酸镁、NaCl( 天津光福科技发展有限公司)。

氟咯草酮原农药由上海泰和集团有限公司提供，供试的马铃薯土壤、叶、根、块茎采自青海高原青薯九号实验田区。

1.2 实验仪器

超高效液相色谱质谱联用仪(液相三重四级杆液质联用仪，LCMS-8040，日本岛津公司)；Shim-pack XR-ODSII柱(2.0mm×75mm，日本Shimadzu公司)；TGL-20B离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.3 样品前处理

马铃薯的叶、块茎、根要打碎成泥状，大颗粒土壤要粉碎。准确称取土壤、马铃薯块茎、叶、根各10.0g于50ml离心管中，随后加入10ml乙腈，振荡涡旋5min，然后加入1gNaCl和4g无水MgSO4,振荡1min后在5000r/min下离心5min。取土壤上清液1.5ml置于装有50mg PSA和100mg无水MgSO4的2ml离心管中；取叶和茎上清液1.5ml于装有150mg PSA、50mg GCB和100mg无水MgSO4的2ml的离心管中；取根上清液1.5ml于装有100mg PSA、25mg GCB和100mg无水MgSO4的2ml的离心管中;块茎上清液的取法与根的一样，取完后，涡旋1min，12000r/min下离心2min,取上清液过0.22μm有机膜，待测。

1.4 标准溶液的配制

用纯色谱乙腈溶解后配置成氟咯草酮的标准储备液。将储备液用纯色谱乙腈逐渐稀释成0.01、0.05、0.10、0.50和1.00mg/L备用标准溶液，在-20℃密封冷冻保存,备用。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

试验采用超高效液相色谱—串联质谱，三重四级杆检测器检定。电喷雾正离子电离源(ESI+)，多反应离子监测模式(MRM)，所用气体为高纯氮气；碰撞气体为氩气；碰撞气体的压力为3.0mbar;离子源温度为120℃；溶剂化温度为250℃；加热块温度为450℃，溶剂化气流量设置为10.0min/L，利用仪器对氟咯草酮进行分析优化，结果如表1所示。

表1 分析物的质谱实验参数Table.1 Mass spectrometric experiment parameters of the analytes

2.1.2 色谱条件的优化

试验考察了乙腈/含甲酸的水、乙腈/含乙酸的水、甲醇和水体系、还比较了含有0.02%(v/v)乙酸的甲醇/水和5mmol乙酸铵的组合作为流动相时的色谱峰形。结果表明，在0.25ml/min的流速下，含有0.02%(v/v)乙酸的甲醇/水和5mmol乙酸铵的组合作为流动相时显示较好的峰形，峰形对称，而且没有其它的杂质峰干扰，而且氟咯草酮具有较好的分离现象，色谱图如图1所示，故选其作为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱的时间程序梯是在注射时以50%色谱甲醇开始，在2min内增加到95%，并保持3min。然后，在5.01min内降至50%，保持时间为3min。本试验还考察了不同柱温箱温度对目标物影响，结果表明在30℃、35℃和40℃的柱温下，40℃时的目标物具有较好的响应值。

2.2 前处理方法的优化

2.2.1 提取剂的优化

本试验中考察乙腈和甲醇作为提取剂时的提取效率，结果表明在1.0mg/kg添加水平下，氟咯草酮在10ml的甲醇中的提取率低于70%，乙腈中的提取率分别为85.2%-90.5%，因此选用提取效果好的乙腈作为提取剂。试验对涡旋振荡时间(2min、3min、5min)进行优化，试验结果发现，随着时间的延长，乙腈提取的效果越明显，提取时间在5min以后，提取的效果不再随时间的延长而增加，结果逐渐趋于稳定，因此选用5min作为振荡涡旋提取时间。

2.2.2 净化剂的选择优化

QuEChERS前处理方法中C18、GCB、PSA、florisil等作为常见的净化剂。C18主要去除非极性和脂肪性物质；PSA主要去除基质中的有机酸、糖类、脂肪酸和一些色素；GCB去除色素和非极性干扰物质[12]。在本试验中，主要选择C18、PSA、GCB作为吸附材料，考察了对目标化合物的吸附情况。结果如图2所示，在100 μg/kg的添加水平下，以乙腈作为提取剂，用相同质量的净化剂提取马铃薯各个基质中的目标物，做三组重复，以GCB作净化剂时，平均回收率在46.2%-49.4%之间，达不到检测要求。以C18、PSA作净化剂时的平均回收率分别在79.5%-83.5%，86.0%-88.1%，能达到农药在农作物中的残留检测要求[13]，根据回收率比较，试验最终决定用PSA作为净化剂。

2.3 方法的线性及相关系数

2.3.1 溶剂标准曲线的绘制

使用配置好的标准溶液配制标准曲线，曲线方程为y=807265x+7560.6，R2=0.9996见图3。

2.3.2 基质标准曲线方程及相关系数

依次吸取不同体积的标准溶液加入取样量相同的空白基质样品中，根据氟咯草酮出峰的保留时间定性，峰面积定量。再以氟咯草酮进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标标准得到四种基质标准曲线，到线性回归方程如表2所示，分别对这些不同的基质进行校正。结果表明，在0.01-1.00mg/L范围内，氟咯草酮在马铃薯不同基质中有良好的线性关系，R2均大于0.9990，符合定量分析要求。

2.4 方法的准确度和精密度

本方法的准确度和精密度通过添加回收率和相对标准偏差来衡量。试验以马铃薯各个基质为空白样品，分别进行3个水平的添加回收试验，在不同的三天内制备样品，每个水平重复5次，具体结果如表3。结果表明，在0.01mg/kg、0.10mg/kg、1.00mg/kg的添加水平下，氟咯草酮在马铃薯各基质中日内平均回收率分别为79.1%-91.6%，80.1%-89.5% 和80.7%-90.0%，相对标准偏差分别在0.9%-4.3%,0.9%-4.1%和1.5%-3.6%之间；日间平均回收率为78.7%-91.6%，相对标准偏差在0.7%-4.3%之间。此结果说明本方法的准确性、精密性符合我国农药残留分析的要求[13]。

表2 不同基质中氟咯草酮校正曲线的线性回归参数Table.2 Linear regression parameters of flurochloridone orrection curves in different matrices

表3 氟咯草酮在不同基质中的回收率及相对标准偏差Table.3 Recovery，RSDr and RSDR values obtained for flurochloridone in different matrices

3 结论

本研究参照胡天良等[14]对氟咯草酮高效液相色谱分析，用乙腈和甲醇分别配制溶液，发现在用乙腈配制标准品时要比甲醇配的好，响应值高，氟咯草酮原药在乙腈中溶解度高于甲醇。结果表明在0.01-1.00mg/L范围内，氟咯草酮溶剂标准曲线良好的线性关系，R2为0.9996。在实验过程中发现，添加水平在0.01-1.00mg/L范围内，调整离子源的位置，会对灵敏度有较大影响，对离子源加以校正，可以提高机器的灵敏度，获得较低的检出限和检测限。总的来说，本试验建立了氟咯草酮在马铃薯各基质中的残留检测方法，结果表明，在0.01-1.00mg/L范围内，氟咯草酮在马铃薯不同基质中有良好的线性关系，R2均大于0.9990。在0.01mg/kg、0.10mg/kg、1.00mg/kg的添加水平下，氟咯草酮在马铃薯各基质中3日内平均回收率分别为79.1%-91.6%,平均相对标准偏差分别在0.9%-4.3%,0.9%-4.1%和1.5%-3.6%之间；日间平均回收率为78.7%-91.6%，相对标准偏差在0.7%-4.3%之间，优化了QuEChERs法在马铃薯田间残留检测的应用，该方法准确性、精密性好，符合我国农药残留分析要求[13]，为氟咯草酮在青海高原田间马铃薯的残留检测分析提供了技术支持。