以色列急性麻痹病毒(IAPV)研究进展

邓 洁，王 帅，陈功文，胡福良，郑火青

（浙江大学动物科学学院，浙江 杭州 310058）

蜜蜂(Apisspp.)是一种重要的经济昆虫，不仅能为人类提供蜂产品，还能为植物授粉，保护生态系统多样性[1,2]。但近几十年来，蜂群损失现象愈发严重[3]。研究表明，蜂群健康受到多种因素影响，主要包括蜜蜂病毒感染、微孢子虫和狄斯瓦螨侵染、农药和杀螨剂残留、气候变化、蜜粉源条件恶化、遗传多样性降低和栖息地缺失等[4]。

病毒感染是影响蜜蜂健康的最重要因素之一[5]。目前在蜂群中发现的病毒已经超过30种[6]。其中大部分病毒为属于传染性软腐病毒科 (Iflaviridae)或双顺反子病毒科(Dicistroviridae)的正义单链RNA病毒。蜂群内最常见且易致病的蜜蜂病毒包括蜜蜂急性麻痹病毒(Acute bee paralysis virus,ABPV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)、残翅病毒(Deformed wing virus,DWV)、克什米尔蜜蜂病毒(Kashmir bee virus,KBV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)和囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)等7种[7]。还有少数蜜蜂病毒为DNA病毒，例如蜜蜂丝状病毒(Apis melliferafilamentous virus,AmFV)和蜜蜂虹彩病毒(Apis iridescentvirus,AIV)[8]。

本文从IAPV的发现与分布、分子结构特征、致病特征、传播途径、检测方法和防治措施等方面进行了系统性的介绍，以期为蜂群中IAPV的检测、分子致病机制和防治等研究提供一定的参考和依据。

1 IAPV的发现与地理分布

1.1 IAPV的发现

IAPV最早在2004年由以色列希伯来大学的Ilan Sela等人发现，由于它的发病症状、系统发育学、生物学和核酸序列等与急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)高度相似，并且给以色列养蜂业造成了严重损失，所以命名为以色列急性麻痹病毒[9-10]。

1.2 IAPV的地理分布

IAPV分布广泛。在国内，我国学者2008年首次在广东的西方蜜蜂蜂群(主要为意大利蜜蜂Apis melliferaligustica，简称意蜂)中检测到了IAPV[11]；2012年发现IAPV也能侵染我国的东方蜜蜂(主要为中华蜜蜂Apis cerana，简称中蜂)[11]。在国外，法国[8]、韩国[12]、美国[13]、以色列[14]、澳大利亚、墨西哥[15]、西班牙[16]、波兰[17]、日本[18]、意大利[19]、巴西[20]、丹麦[21]、土耳其[22]、南非[23]、约旦[24]和越南[25]等除南极洲以外的各大洲的西方蜜蜂中也都有检测到IAPV。

根据ORF1区域的遗传多样性，IAPV有3个典型基因型，包括澳大利亚、美国的2个基因型以及在中国、以色列和韩国地区检测到的1个基因型[26-27]。

2 IAPV的分子结构特征

IAPV是正义单链RNA病毒，属仿小核糖核酸病毒目(Picorna-likevirus)双顺反子病毒科(Dicistroviridae)，具有一个无被膜的20面体蛋白外壳，病毒粒子直径为20～30 nm，在氯化铯中的浮力密度为1.33～1.42 g/mL，沉降系数为100～190 S[28-29]。

IAPV基因组由9 487个核糖核苷酸组成(不包括poly(A)尾巴)，包含2个不重叠的开放阅读框(open reading frame,ORF)，分别编码含有非结构蛋白和结构蛋白的多蛋白，靠3'端的O RF由908个氨基酸组成，这2个O RF被184个核苷酸间隔开；终止密码子位于结构蛋白的C末端附近，紧接着是甲硫氨酸密码子，所以可能会发生通读，翻译合成含944个氨基酸的序列[10,30]。

IAPV病毒粒子呈球形，其最大外径为34 nm，由衣壳蛋白VP1、VP2和VP3以伪T=320面体对称性排列而成，次要衣壳蛋白VP4附着在衣壳的内表面。VP1亚基围绕5倍轴形成五聚体，VP2和VP3亚基围绕20面体3倍轴构成交替的异六聚体，3种主要的衣壳蛋白均具有β夹心折叠结构，且其N末端位于衣壳内部，C末端暴露在病毒体表面[31]。

由于IAPV空衣壳结构紧凑，不含可能用作基因组释放通道的孔，因此，IAPV基因组可能是通过衣壳壁中独特区域重排形成的孔进行释放和传递，基因组释放后该孔则会关闭[32]。

3 IAPV的致病性

3.1 IAPV与蜂群崩溃失调症

2006年底，美国出现蜂群异常损失的现象，之后蔓延到美国的35个州和加拿大部分地区，造成了30%～90%的蜂群损失率，这种现象被命名为蜂群崩溃失调症(Colony Collapse Disorder,CCD)[33]。患有CCD的蜂群看起来很健康，没有任何疾病迹象，但大量成年工蜂在短时间内消失，并且蜂箱周围没有工蜂的尸体，但蜂王、幼虫、未成年的工蜂以及蜜蜂食物等仍留在蜂箱中。由于CCD事件的发生，全球农业授粉危机和生态危机受到了社会各界的广泛关注，与之相关的蜜蜂病毒病也逐渐被重视[9]。

最初，IAPV被认为是导致CCD的主要因素[10]。之后的研究表明，CCD爆发可能是病毒和其他病原微生物等多因素作用的结果，例如狄斯瓦螨、微孢子虫与IAPV和DWV等病毒的综合作用[35]。虽然后续的研究并没有发现IAPV与CCD之间的必然联系[36]，但IAPV对蜂群的影响仍不容忽视。

3.2 IAPV的致病特征

IAPV可以导致蜜蜂的全身感染。在发病早期，蜜蜂的唯一症状是腹部尾端变黑；发病中期，蜜蜂的胸部变暗，不停地在蜂箱附件转圈，几乎不飞行和觅食；发病后期，蜜蜂肢体会出现麻痹和发抖的症状，经过一段时间的抽搐、痉挛，最终死亡。被IAPV感染的蜜蜂会出现行为、认知障碍和学习、记忆能力衰退等现象[30,37]。此外，IAPV感染不仅会降低蜜蜂的归巢能力，而且会缩短蜜蜂的寿命[38]。

3.3 IAPV与冬季越冬蜂群损失

多项在美国和德国的长期调查表明IAPV等病毒与冬季蜂群损失间有紧密联系[6,9]。近年来，我国的西方蜜蜂蜂群也出现了蜂群大量损失的现象[40-41]。陈功文等对浙江省3个蜂场的48群蜜蜂进行了跟踪调查，探究了与越冬期蜜蜂健康紧密相关的病毒种类，发现IAPV是影响越冬期意蜂健康的重要因素[7]。

4 IAPV的感染与传播

4.1 IAPV的宿主

IAPV首次在西方蜜蜂上发现[10]，已知还能感染东方蜜蜂、熊蜂和胡蜂等授粉昆虫[18,42-44]。在熊蜂和西方蜜蜂上已有IAPV致病性相关的报道。在熊蜂上，IAPV能侵染其各个组织，且主要富集在肠道和脂肪体等组织[45-46]。

IAPV不仅能侵染多种授粉昆虫，还能侵染其他非授粉昆虫。目前，有研究发现寄生蜂、蜂箱小甲虫和蜚蠊目、革翅目、鳞翅目昆虫以及蛛形纲的动物中都能检测到IAPV[44,47]，但这些昆虫是取食了受感染的蜜蜂或者其他食物还是真正的感染了该病毒，仍需进一步研究来明确。

4.2 IAPV的组织分布

感染了IAPV的蜜蜂，其血淋巴、脑、脂肪体、唾液腺、咽下腺、肠、神经、气管和肌肉中均能检测到该病毒，但不同组织中IAPV病毒基因组拷贝数的相对丰度差异较大，由低到高依次为：肌肉<脂肪体<大脑<气管<唾液腺<咽下腺<神经<肠道。神经组织的IAPV含量相对其他组织较高，这与蜜蜂发病时出现麻痹、发抖、抽搐等症状也紧密相关。原位杂交显示IAPV特异性信号也存在于受感染蜂王的卵子、卵巢和精子以及肠道中[26]。IAPV也可以在胡蜂的中肠、脂肪体、脑和卵巢等组织中累积，其中脂肪体的含量最高[45]。

4.3 IAPV的扩增特性

蜜蜂通常被多种病毒共同感染[48]，所以直接从自然感染的成年蜜蜂中分离出单一的IAPV病毒十分困难。Humberto等[49]通过对意蜂工蜂蛹进行一系列的病毒接种和纯化实验发现，注射接种富含IAPV的混合病毒液(IAPV、BQCV、ABPV和DWV)20 h后，工蜂蛹体内的IAPV大量扩增且蜂蛹只能发育到粉眼阶段。利用接种混合病毒液5d后的工蜂蛹提取病毒液，将病毒液再次注射到工蜂体内，如此重复2次，所提取的病毒液中仅含IAPV，且IAPV的含量至少为每微升含105个病毒粒子[63]。利用该方法可以实现对IAPV的富集，获得纯度很高的IAPV病毒液。

IAPV在成年工蜂中也具有类似的扩增特性。Carrillo-Tripp等[50]使用富含SBV的混合病毒液(SBV、IAPV、DWV和BQCV)感染意蜂工蜂，发现IAPV在接种24 h后显著增加，并且只有IAPV滴度在所有检测时间点(12 h、36 h和60 h)都升高。与其他病毒相比，IAPV在蜜蜂蛹期和成蜂期的扩增都具有显著优势，这可能与IAPV的急性致病特征有关，但具体的作用机制仍需进一步研究。基于IAPV的扩增特性，其对蜜蜂的影响更不容忽视。

4.4 IAPV的传播途径

蜜蜂病毒在蜂群中主要有2种传播途径：水平传播和垂直传播[51]。水平传播是指病毒在同一世代的不同个体间扩散。水平传播主要有4种途径，分别是饲粮、体表接触、蜂王交尾和虫媒传播。垂直传播指蜜蜂病毒可以通过蜂王的繁殖，在成年蜜蜂与其子代个体之间传播[13]。

IAPV能通过水平传播侵染各个级型和发育时期的蜜蜂。蜜蜂在取食被病毒颗粒污染的食物、哺育蜂在饲喂患病蜂王和幼虫以及内勤蜂在清理患病幼虫时，都会接触并传播IAPV[37]。此外，狄斯瓦螨在吸食不同蜜蜂的血淋巴时也能促进IAPV在蜂群中的传播[52]。

在蜂王储精囊和卵巢内的生殖细胞以及雄蜂精液中也能检测到IAPV，表明其不仅可以通过交配行为在蜂群内水平传播，也可以通过垂直传播进行扩散[26]。

5 IAPV的检测方法

5.1 IAPV检测难点

由于蜜蜂病毒大部分情况下为隐性感染，且IAPV和A B PV的致病症状极为相似，所以很难通过表观症状判断蜂群是否感染IAPV[30,53]。而即使通过分子生物学检测，也存在难点。

ABPV、KBV和IAPV均属于典型的双顺反子病毒科病毒，ABPV和IAPV之间的基因同源性为92%，而KBV和IAPV之间的基因同源性高达96%。由于病毒的氨基酸序列高度相似，所以IAPV曾被认为是KBV的一个变种或者亚型；最初的几年里，IAPV也常被误报道为KBV[53-54]。例如，韩国、俄罗斯、约旦、澳大利亚检测到的某些病毒序列其实是将IAPV误报道为KBV[53,55]。此外，也有KBV被报道为IAPV的情况发生[56]。ABPV、KBV和IAPV间的相似性使得病毒种类的鉴定、分类以及流行病学调查变得困难，但随着检测方法的优化，已能准确地对这3种病毒进行区分。

5.2 基于核酸序列的检测方法

近年来，随着核酸分子检测技术的发展，检测病毒的手段也不断创新。基于聚合酶链式反应(PCR)的检测是一种常用方法。实时荧光定量PCR方法(Realtime-qPCR)被证明比酶联免疫吸附测定(ELISA)或常规PCR更为灵敏[57]；巢式PCR可以提高从环境样品中检测蜜蜂病原体的灵敏度；多点超快速实时PCR(UR-qPCR)则可以快速地同时检测多种蜜蜂病原体[58]。

与KBV和ABPV相比，IAPV的聚合酶多蛋白基因(polymerase polyprotein)相对保守[53]，张体银等[59]针对该基因建立了快速检测IAPV的常规PCR方法。

UR-qPCR方法能针对IAPV基因组内的多个检测位点进行检测，利用3对引物同时扩增RNA依赖性RNA聚合酶基因(RdRp)和2个衣壳蛋白基因(VP1和VP3)，不仅提高了检测的准确性，也降低了引物设计对检测结果的影响；此外，该方法还可以用于快速筛选IAPV基因组特定区域中的突变位点[60]。

2020年，Cagirgan和Yazici基于多重RT-PCR技术开发了一种可以同时检测ABPV、BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV的方法，具有较高的特异性和准确性，但该检测方法灵敏度较低，不适用于蜂群中病毒滴度较低时的检测[61]。

5.3 其他检测方法

病毒形态学检测虽然能较为准确地测定蜜蜂病毒颗粒的大小、外型和侵染位置，但在电镜下无法直观地区分病毒颗粒的种类。此外，样本处理的复杂性和设备的昂贵使得这一检测方法不便用于常规鉴定。

基于免疫学原理的病毒检测方法可用于基层检验部门的快速检测。目前，利用该方法已研制了可以用于CSBV临床检测的双抗夹心ELISA检测试剂盒[62]，该试剂盒具有较高的灵敏性和准确性。但由于IAPV与ABPV、KBV具有较高的基因同源性，应用该方法进行IAPV的检测会存在特异性较差等问题。

6 IAPV的防治

目前，仍没有能治疗IAPV感染的经济、有效措施。在生产上，对包括IAPV等病毒引起的蜜蜂病毒病都只能以预防为主，通过综合性的手段保持蜂群健康，增强蜜蜂抵抗力。适当的补助饲喂和保温都能增强蜂群对病毒的抵抗能力。对于患病蜂群，可以通过断子清巢来减少病原对蜂群产生持续性损害，同时，烧毁患病严重的子脾、适时更换巢脾和更换患病蜂王也可以减少病毒的进一步扩散。

蜂螨与蜜蜂病毒的协同作用与蜂群的群势下降密切相关[63]。当瓦螨侵染蜜蜂时，隐性感染的病毒会快速增殖，从而使蜜蜂出现患病症状，导致蜜蜂死亡甚至蜂群崩溃[37]，所以及时地防螨治螨，增强蜂群的抵抗力对预防蜂群感染IAPV及其他病毒十分重要。

Maori等[30]合成了来源于IAPV基因序列的双链RNA(dsRNA)，并饲喂给被IAPV感染的实验蜂群，使得IAPV出现基因沉默的现象，从而降低了蜂群中IAPV的感染量，改善了感染IAPV蜂群的整体健康状况，所以RNA干扰技术(RNAi)也是控制IAPV的有效途径[64]，但由于dsRNA生产成本较高，在实际生产上这一治疗手段并未得到广泛应用。

7 小结与展望

IAPV是一种宿主范围广，对蜜蜂致病性高的常见病毒。对其流行病学、致病性等开展研究，不仅关系到蜂群健康和蜂业发展，同时对于维护农业发展和保护野生授粉昆虫都有重要意义。根据本课题组近年来开展的流行病学调查研究，IAPV在东方蜜蜂上的感染率也较高。鉴于IAPV在西方蜜蜂上的致病性，IAPV对东方蜜蜂等其他宿主的致病性亟待进一步研究确认。

IAPV的防控是个极具挑战但又必须面对的问题。蜂群用药存在蜂产品质量安全问题的风险，靶向用药不是唯一选择，综合防控是基本原则。IAPV与其他病原间的关系及在不同条件下的致病性研究一方面有助于增加对IAPV致病机制的了解，另一方面也有助于IAPV的防控。

针对IAPV的研究多集中于流行病学调查和致病性，对其致病机理的研究仍然较为缺乏。其中原因和缺少相应的体外研究模型(无可用的成熟蜜蜂细胞系)有关。IAPV致病伴随有明显神经性症状，未来可以蜜蜂为材料研究该病毒感染与其致病症状间的联系，探讨其致病机制。同时，该病毒在不同物种宿主间的传播及适应，在病毒的进化和跨物种传播方面也很有研究价值。