ZEB蛋白及其相关miRNA、LncRNA在卵巢癌上皮间质转化中的作用①

徐 红，阳 华②

(1.桂林医学院，广西 桂林 541199;2.桂林医学院第二附属医院，广西 桂林 541199)

卵巢癌(ovarian cancer)是常见的妇科恶性肿瘤之一，约占女性生殖道肿瘤的23%，但病死率约占妇科恶性肿瘤的47%[1]，是全世界女性癌症死亡的第5大常见原因。卵巢癌由于发病隐匿，进展迅速，缺乏有效的早期诊断方法，5年生存率仅3%～19%[2]。卵巢癌发生侵袭和转移的主要方式是上皮—间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition， EMT)，而锌指E盒结合同源异型盒-1(ZEB1)是 EMT 主要的转录因子之一，在EMT中的作用已引起重视，近年来ZEB蛋白与microRNA、LncRNA在卵巢癌EMT中的作用研究较多，本文就其研究进展作一综述。

1 上皮间质转化(EMT)

EMT是指上皮细胞丢失了细胞—细胞之间的紧密连接而获得了间质细胞的特性，最早是由Greenburg和他的同事在1982年提出[3]。EMT在胚胎发育、伤口愈合、组织再生和器官纤维化及癌细胞转移等方面都发挥着重要作用[4]。上皮细胞发生EMT的主要步骤：①上皮细胞标记物表达减少，如E-cadherin、α连环蛋白(α-catenin)、β-catenin、桥粒斑蛋白、角蛋白、黏蛋白、紧密连接蛋白(ZO-1)等；②间质细胞标记物表达增加，如神经性—钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、成纤维细胞特异性蛋白、纤黏连蛋白等，同时，辅助诱导EMT过程的基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、Ⅰ型胶原等表达亦上调；③细胞表型改变，上皮细胞表型转化为间质细胞表型，出现丝状伪足和层状伪足，细胞开始具有浸润性和游走迁移能力；④E-cadherin的下降使细胞质中少量的游离状态的β-catenin聚集；⑤β-catenin入核后介导一系列信号转导通路，参与调控肿瘤生长和转移过程[5]。其中上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin)的表达下调，同时神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)的表达增加是肿瘤细胞EMT的主要标志，此表达可增强肿瘤内皮和间质成分的相互作用，促进肿瘤发生侵袭、转移，可使良性肿瘤向转移性肿瘤发展，并可侵袭、转移到其他组织。

研究证实，肿瘤微环境中的多种转录因子(如锌指结构因子ZEB家族、Snail 转录因子家族、螺旋环螺旋因子Twist、NAC1、ALX1等)活化表达及生长因子，如转化生长因子-β(TGF-β)，肝细胞生长因子(HGF)，表皮生长因子(EGF)，影响细胞黏附分子和细胞骨架功能，这些均可诱导EMT发生，这些因子可与上皮细胞表面的相应受体结合，经不同的信号转导通路(TGF-β信号通路、Wnt 信号通路、Notch 信号通路、Hedgehog信号通路以及NF-κB信号通路)形成了复杂的EMT调控网络，诱导肿瘤发生EMT，增强肿瘤侵袭、转移能力[6]。胚胎分化过程中上皮—间充质和间充质—上皮转化(EMT 和 MET)表明上皮细胞有可塑性，这也是癌症发展的机制。Hill 等[7]研究表明，ZEB 蛋白家族成员ZEB1、ZEB2等转录因子及相关microRNA(主要是 miR-200 家族成员)形成负反馈回路，调控 EMT 和 MET 转变及肿瘤发展。

2 ZEB蛋白

ZEB蛋白(zinc finger E-boxbinding homeobox， ZEB)是一类E盒结合锌指蛋白，是重要的细胞核转录因子之一，由锌指E盒结合同源异型盒-1(ZEB1)和锌指E-box结合盒-2(ZEB2)组成。ZEB1基因位于10p11.2号染色体上，其蛋白质由位于N和C末端的两个锌指簇组成，而ZEB1蛋白质的中间包含3个不同的部分，分别为同源结构域、Smad相互作用结构域和C末端结合蛋白(CtBP)，这些结构域有助于调控ZEB1的转录活性。因此，尽管ZEB1、ZEB2同属ZEB家族，最初认为能与CtBP辅抑制因子相互作用而产生的转录抑制因子，也可与p300和P/CAF等辅激活因子的相互作用而激活，这种双重活性在EMT的调控中尤为重要[8]。

ZEB家族具有多种生物学功能， Zweier等[9]发现ZEB1 突变与内皮细胞迁移缺陷导致的多形性角膜营养不良有关。ZEB-1 是一种由 TCF8 基因编码的 190～210 kD的蛋白，是 EMT 的重要诱导物，Chen等[10]分析发现，证明ZEB-1的过度表达与结肠直肠癌、胃癌、肝细胞癌、 胰腺癌、食管鳞状细胞癌、口腔癌和肝内胆管癌等实体癌密切相关，其表达水平对患者的存活率有重要影响。在大多数实体瘤中，ZEB-1的过表达与较差的总生存期(overall survival，OS)相关，ZEB-1可能是一种潜在的预后标志物，也是人类实体瘤的新治疗靶点。ZEB2 等位基因的突变会导致 Mowat-Wilson 综合征，这是一种表现为颅面异常、智力低下、色素沉着缺陷等为特征的先天性疾病[9]。虽然ZEB2的作用尚未在癌症干细胞(CSC)中进行过系统研究，但最近的研究认为它对正常胚胎干细胞有重要的生物学作用，Goossens等[11]研究发现， ZEB2通过促进神经外胚层和抑制中内胚层的发育来调节人类胚胎干细胞的分化，维持多能性的干细胞因子NANOG、OCT4抑制ZEB2的转录，反过来NANOG也受ZEB2抑制，表明 ZEB2 调节胚胎干细胞的自我更新与分化。

近年来，ZEB蛋白及调节因子在肿瘤细胞中的研究较多，其中ZEB蛋白及其相关分子miRNA、LncRNA在卵巢癌上皮间质转化中的作用引起了关注。

2.1 微小RNA(microRNA)

MicroRNA(miRNA)是长度约22个核苷酸的短单链非编码RNA，能够与靶信使RNA(mRNA)中的互补位点结合形成沉默复合物(RISC)，诱导mRNA降解、抑制翻译，负调控基因表达[12]。miRNA被公认为是癌症中的分子调节因子和潜在的治疗靶标。Ashrafizadeh等[13]研究表明，miRNAs(miRs)在肿瘤细胞中的作用具有双重性，一方面，miRs可以作为抑癌因子，通过下调ZEB1/2，抑制上皮—间质转化(EMT)，削弱肿瘤细胞的转移。另一方面，miRs也可以作为癌症扩散的促进因子，上调ZEB蛋白，促进EMT和肿瘤转移。

2.2 ZEB与miR-200在卵巢癌EMT中的作用

miRNA种类多，其中miR-200家族是研究的热点之一。miR-200家族由5个miRNA序列组成：miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429[14]。miR-200介导的EMT途径中的两个关键分子靶标是SMAD(SMAD2和SMAD3)和ZEB家族(ZEB1和ZEB2)。笔者就miR-200与ZEB在卵巢癌中作用进行探析。

miR-200家族抑制ZEB1和ZEB2表达，从而维持上皮表型、抑制 EMT。Gregory等[15]研究认为，由于miRNA-200家族与ZEB1和ZEB2 mRNA的3’UTR的8个和9个位点结合，miRNA-200 家族可直接抑制 ZEB蛋白的表达，同时靶向ZEB蛋白的miRNA。ZEB1和ZEB2的3’UTRs分别包含1个和2个位点，分别为miRNA-205与 miRNA-200，共同下调ZEB蛋白的表达，导致MET。

Chung等[16]发现，miRNA-200b/a被确定为转录因子类颗粒蛋白2(GRHL2)的直接转录靶点，并通过ZEB1和E-cadherin调节卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)的上皮状态，在EOC的上皮间质转化中发挥重要作用。Cao等[17]研究表明， miR-200a和miR-200b高表达与卵巢癌分期和恶性程度相关，而miR-200c高表达仅与疾病的晚期相关。Sestito等[18]研究揭示，内皮素A受体(ETR)和ZEB1在间叶性卵巢癌(mesenchymal ovarian cancer，MOC)中表达上调，ETR和ZEB1的表达与miR-200b/c呈负相关，ETR-miR-200b/c-ZEB1通路促进上皮—间充质转化，促进卵巢癌的转移与进展。Hurteau等[19]研究发现，miR-200c可以恢复E-钙黏蛋白的表达，在间质到上皮的形态改变中起着重要作用， She等[20]研究表明，miR-200c高表达的卵巢癌较低表达的生存率提高。Ye等[21]研究发现miR-141过度表达会导致E-钙黏蛋白上调，锌指E-box结合同源异型盒(ZEB)的下调，抑制细胞增殖和EMT，并降低SKOV3细胞侵袭与迁移。Yao等[22]研究发现LncRNA GIHCG表达与miR-429正相关，并通过调节miR-429促进卵巢癌的发展。Korpal等[23]研究表明EMT过程中，ZEB1和ZEB2抑制miR-200家族成员表达，在上皮间质转化过程中抑制E-cadherin表达，促进迁移和侵袭。由此，miR-200a/b、miR-429可通过ZEB1、ETR等途径促进卵巢癌上皮间质转化，而miR-200c与miR-141在卵巢癌上皮间质转化中起抑制作用。

2.3 ZEB蛋白与其他相关miRNA在卵巢癌EMT中的作用

除miR-200家族外，如miR-1271、MiR-199B-3p、MiR-101等也在卵巢癌上皮间质转化中发挥作用。Jiao等[24]发现在卵巢癌细胞中，锌指E-box结合同源盒1(ZEB1)是miR-1271的靶基因，其表达受到卵巢癌中miR-1271的调节， miR-1271抑制了SKOV3 细胞的活力和EMT，表明ZEB1可部分逆转miR-1271对卵巢癌的生存能力和侵袭作用。miR-1271的表达与卵巢癌组织中ZEB1的表达负相关，miR-1271通过下调ZEB1(与3’-UTR结合)抑制EMT，导致肿瘤细胞的活力、增殖、侵袭和迁移降低，miR-1271的下调预示卵巢癌患者的不良预后。Wei等[25]在研究中发现，ZEB1低表达患者的总生存期(overall survival，OS)和无病生存期(disease-free survival，DFS)均长于ZEB1高表达患者，而 MiRNA-199b-3p过表达可抑制ZEB1和检查点激酶1的表达，诱导E-cadherin的表达和上皮向间充质的转变；同时，ZEB1和E-cadherin分别减弱了miRNA-199b-3p介导的细胞凋亡和迁移效应，由此，miRNA-199b-3p可通过靶向ZEB1抑制卵巢癌的进展。Guo等[26]发现miR-101可通过直接靶向ZEB1和ZEB2的3’非翻译区(3’UTR)来抑制E-钙黏素抑制子ZEB1和ZEB2的表达。MiR-101能显著抑制EMT和细胞的迁移和侵袭。不含3’UTR的ZEB1和ZEB2的cDNA分别阻断了miR-101诱导EMT。Ashrafizadeh等[13]研究发现，miRs的上游调节子如长非编码RNA(lncRNAs)和环状RNA(circRNAs)可能会抑制miRs对ZEB蛋白及癌症的作用。

2.4 长链非编码RNA(LncRNA)

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一个长度超过200个核苷酸的转录物，不会翻译成蛋白质[27]。LncRNA在基因表达的不同水平上发挥调节功能，包括染色质的修饰、转录和转录后翻译，在肿瘤细胞中发挥重要作用。与卵巢癌上皮间质转化相关的lncRNA有许多，如肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1)已被证明能促进卵巢癌细胞的侵袭、迁移与增殖；H19基因是与恶性肿瘤相关的LncRNA，可促进卵巢癌的EMT过程；HOTAIR 是由 HOXC 位点转录而来的 LncRNA，可通过影响卵巢癌的EMT过程影响患者的生存期；HOXA11as、TUG1、CCAT1、Linc-ROR等均可促进卵巢癌上皮间质转化；而MEG3 属于 DLK1-MEG3 的印记基因，位于人染色体 14q32.3， 是第一个被发现的具有肿瘤抑制作用的印记 LncRNA，在卵巢癌中表达下调[28]。Chen等[29]首次发现MALAT1与卵巢癌患者的远处转移密切相关，抑制MALAT1可抑制卵巢癌细胞的致瘤性。此外，沉默MALAT1通过下调PI3K/AKT通路来阻止上皮—间充质转化(EMT)和卵巢癌细胞的转移[30]。

2.5 ZEB相关lncRNA在卵巢癌EMT中的作用

LncRNA影响卵巢癌EMT包括内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的竞争性抑制miRNA，影响下游分子的表达以及调节EMT相关的经典信号通路等，并可激活转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等信号通路，调控E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-cadherin、波形蛋白、锌指转录因子Snail超家族、ZEB1和ZEB2等蛋白，诱导EMT进程，影响卵巢癌的侵袭转移。

Gao等[31]的相关研究表明，过表达miR-200a的EOC细胞，LncRNA膜相关鸟苷酸激酶倒置1-内含子转录本(MAGI1-IT1)可以通过竞争性结合miR-200a上调ZEB1和ZEB2促进EOC转移，抑制miR-200a和上调ZEB1和ZEB2，逆转MAGI1-IT1缺失对EOC转移的抑制作用。Shu等[32]发现， lncARSR通过竞争性结合miR-200家族诱导EMT和侵袭，增加ZEB1和ZEB2的表达，同时LncARSR在卵巢癌组织中的表达显著升高，并与FIGO分期、组织学分级、淋巴结转移和预后不良有关。Liang等[33]研究发现，LncRNA PTAR表达与间充质卵巢癌样品中ZEB1的表达水平呈正相关，可以作为miR-101的内源竞争RNA(competing endogenous RNAs， ceRNA)，抑制miR-101-3p的功能及其表达，使miR-101-3p对ZEB1的抑制功能减弱，进而促进卵巢癌迁移、侵袭与EMT。沉默miR-101促进细胞迁移，而miR-101的过表达通过ZEB1抑制了卵巢癌细胞系的EMT与迁移。

ZEB蛋白在卵巢癌侵袭、转移中的作用机制及其与LncRNAs和circRNAs 相互作用有待于深入研究，这有可能为卵巢癌的诊断和治疗提供新的线索。另外，ZEB蛋白在卵巢癌化疗耐药等方面的研究取得了一些进展，也值得深入探讨和研究。