超量表达DWF4基因对芥菜生长发育的影响

兰彩耘， 宋洪元

1. 重庆市江津区现代农业园区发展中心，重庆 江津 402260；2. 西南大学 园艺园林学院，重庆 400715

BR缺陷突变体如拟南芥中的DET2，DWARF4(DWF4)和CPD，番茄中的DWARF，豆科植物中的LKB；BR不敏感突变体如拟南芥中的DWF12，BRI1，BIN2，BAK1，豆科植物中的LKA，番茄中的CURL-3等都不同程度表现为根长、株高、花序、角果、叶柄、胚轴的减短、顶端优势的减弱、育性衰减、开花和叶片卷曲、维管束和光形态建成上的变化，显示BR在植株生长和发育中的重要作用[1]．通过在植株中超表达DWF4基因，可以使植株更高，叶片更多[2]．目前还发现BR和其他激素在侧根发生方面起到的协同作用[3]，然而对于下胚轴和根的向地性方面起到的却是反作用．低浓度水平下的BR促进根的伸长，高浓度则抑制根的伸长[3]．多种实验结果证明BR能促进产量提高．水稻BR缺陷突变体BRD2致使谷物颗粒变短而且缩小，而DWF11突变体也呈现出种子减少现象[4]．相反，超表达BR生物合成基因将增大水稻颗粒，增加水稻产量，转基因水稻与野生型相比，分蘖数更多[5]．在拟南芥中，BR对种子发育有决定性作用，包括种子大小、种子形状和种子数量等[6]．拟南芥BR缺陷突变体DWF5结出的种子变小[7]，BR缺陷突变体DET2和BRI1-5的种子也都比野生型小，而且DET2 和BRI1-5的种子质量比野生型分别轻17%和10%，BZR1功能获得型突变体BZR1-1D的种子与野生型相比，不仅更小而且变得更轻[6]．在拟南芥中，超表达DWF4可以提高种子数量．就如Choe等[2]研究过表达BR合成关键基因，获得了转基因拟南芥植株，对该转基因植株的果荚和分枝数统计调查显示其数量均增加2倍，种子产量增加了59%，GC-MS分析表明该转基因植株內源BR水平确实有所升高．另外，BR还调节植物花期和衰老．BR相关基因CPD，可以通过光周期途径调节开花，而CPD同系物GmCPDs促成开花发育，调控花期[8]．水稻BR信号途径相关基因SDG725，也和花期调控相关[9]．

目前，在BR的生物合成、代谢作用、信号转导途径中都有很多报道，其中DWF4编码细胞色素P450酶，与CPD基因处于同一家族不同亚族[10]．DWF4的mRNA水平因外源施加油菜素内酯(brassinolide，BL)而大幅下降，因施加BRZ(油菜素内酯抑制剂)而大幅提高，证实DWF4在BR平衡调节上起到了重要的作用[11]．DWF4敲除突变体的内源BRs缺失将致使植株矮小，突变体植株细胞伸长受到限制[12]．对野生型植株施加BRZ，将抑制或结合DWF4酶[13]，也会造成内源BRs缺失致使植株矮小．DWF4是维持BR平衡的关键基因，因其可以迅速而准确地对内源BR水平响应表达变化[14]．本实验中通过农杆菌介导转化法将DWF4基因导入芥菜中，研究DWF4基因在芥菜生长过程中的作用与功能，为解析DWF4基因参与BR信号传导的机制提供直接或者间接的实验证据，也为今后开发生物技术手段调控植物生长发育奠定理论基础．

1 材料与方法

1.1 材 料

含pCABarDWF4植物表达载体质粒的农杆菌由西南大学蔬菜学实验室提供，表达载体结构示意图见图1．

图1 pCABarDWF4植物表达载体结构结构图

1.2 芥菜遗传转化

利用农杆菌介导法转化芥菜，芥菜种子所需消毒时间为75%的乙醇消毒1 min，0.1%的升汞处理8 min，所需农杆菌侵染时间为8 min，使用的预培养基成分为MS+2 mg/L 6-BA(6-苄基腺嘌呤)+0.2 mg/L NAA(萘乙酸)；筛选培养基成分为MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+8 mg/L PPT(膦丝菌素)+400 mg/L Carb(羧苄青霉素)；生根培养基成分为MS+0.2 mg/L NAA+8 mg/L PPT+400 mg/L Carb．

1.3 转基因芥菜植株的PCR鉴定

采用CTAB法提取获得的转基因芥菜植株基因组DNA进行PCR扩增．引物DWF4-1和DWF4-2用于pCABarDWF4转基因芥菜植株DWF4基因片段的检测．PCR扩增参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 40 s；56 ℃ 40 s；72 ℃延伸2 min；30个循环；72 ℃延伸10 min．获得的扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测．

1.4 pCABarDWF4转基因芥菜植株DWF4基因、BR生物合成结构基因、转录调控基因的表达分析

用TIANGEN RNA prep pure Plant Kit提取试剂盒提取pCABarDWF4转基因芥菜植株总RNA，根据TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TaKaRa)试剂盒说明书进行cDNA合成，获得的第一链cDNA稀释5倍后作为RT-PCR模板．以芥菜BjActin为内参，对转基因植株和非转基因植株中的DWF4基因BR生物合成结构基因的表达情况进行Real Time RT-PCR分析，反应在C1000/CFX96 仪器(Bio-Rad，美国)上完成，具体操作按照SYBR©Premix Ex TaqTMII说明书进行．利用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪CFX Manager Software 软件(2-ΔΔCT法)和Microsoft Excel软件分析数据．

1.5 pCABarDWF4转基因芥菜植株形态分析

pCABarDWF4转基因芥菜植株及非转基因植株种子播种于培养皿中，铺上滤纸，只施加蒸馏水，置于25 ℃培养室中，光照条件和黑暗条件下培养4 d，每个基因型进行3次重复，每个重复20粒种子，最后调查其根长、下胚轴长、总长，在滤纸上吸干水后测其鲜质量，最后置于60 ℃烘箱中烘干测其干质量．pCABarDWF4转基因芥菜植株及非转基因植株播种于培养盆中，播种后每隔15 d测量其株高、开展度、单株最大叶长和最大叶宽，自花授粉结束后测量主枝长度、主枝果荚数、主枝种子数、一次分枝数、一次分枝果荚数、一次分枝种子数、二次分枝数、二次分枝果荚数、二次分枝种子数并测量千粒质量和籽粒密度．千粒质量的测定：转基因植株和野生型植株种子分别取100粒称质量，3次重复，取其平均值．籽粒密度(D)的测定：取200粒称质量记为M，然后将籽粒放入事先盛有定量体积V1酒精的量筒中，然后读取体积V2，则籽粒体积V=V2-V1．籽粒密度D=M/V，单位g/mL，3次重复．

2 结果与分析

2.1 pCABarDWF4转基因芥菜植株的获得及鉴定

PCABarDWF4表达载体通过农杆菌介导的下胚轴转化，侵染后的下胚轴转接至含8 mg/L PPT和400 mg/L Carb的抑菌筛选培养基上，对获得的不定芽进行多代筛选，淘汰未转化的白化芽和嵌合体，获得多个具PPT抗性的绿色愈伤组织和芽(图2a和图2b)，抗性芽接种至生根培养基上进行生根培养(图2c)．抗性植株炼苗后，移栽至泥炭土营养钵中(图2d)，最后定植于大田中，正常管理至植株开花．提取pCABarDWF4转基因芥菜植株T0代基因组DNA从3株转基因植株中扩增到预期大小300 bp左右的目的片段(图2e)．

M为DNA相对分子质量标准；D1，D2和D3为野生型植株；WT为野生型植株；CK+为阳性对照(质粒)；CK-为阴性对照(未加入DNA)．

2.2 pCABarDWF4转基因芥菜植株DWF4基因的表达分析

提取pCABarDWF4转基因芥菜植株的RNA，以芥菜BjActin为内参进行DWF4基因的定量表达分析．从结果(图3)可以看出，pCABarDWF4转基因芥菜D1，D2和D3植株中，DWF4基因均有不同程度的表达，但表达量在植株之间有差异，D2和D3植株中目的基因表达量较高，对照野生型植株(WT)未检测到明显的DWF4表达．

D1，D2和D3为转基因植株，WT为野生型植株；小写字母不同表示p<0.05，差异有统计学意义．

2.3 pCABarDWF4转基因芥菜植株苗期光暗处理表现分析

将pCABarDWF4转基因芥菜种子进行光照处理后调查其生长状况．从表1可以看出，D2和D3的根长显著高于野生型，D1的根长虽然高于野生型但未达到统计学意义．D1和D3的下胚轴长显著高于野生型．D1，D2和D3苗期总长均显著高于野生型．在鲜质量方面，转基因植株以及野生型植株之间差异无统计学意义．在干质量方面，D1和D3显著高于野生型，D2的干质量虽然高于野生型但差异无统计学意义．相比之下，苗期生长最为旺盛的是D3．综上所述，在光照条件下，在芥菜中超表达DWF4基因能一定程度上促进苗期生长．

表1 pCABarDWF4转基因芥菜植株T2代光照下苗期调查

与光照条件下相比，在黑暗中，不管是转基因植株还是野生型植株，苗期下胚轴都大幅度伸长，但植株纤弱，子叶黄化．从表2中可以看出，D2和D3的根长显著高于野生型，D1的根长虽然高于野生型但差异无统计学意义．D1和D3苗期下胚轴长均显著高于野生型，D2下胚轴长低于野生型．在苗期总长上，D1和D3显著高于野生型，由于D2下胚长较短的原因，所以其总长与野生型差异无统计学意义．在鲜质量和干质量上，转基因植株与野生型植株之间差异无统计学意义．从实验结果可以看出，在黑暗条件下，DWF4基因能在一定程度上促进苗期根和下胚轴伸长．

表2 pCABarDWF4转基因芥菜植株T2代黑暗处理下苗期调查

光照条件与黑暗条件下不同的是，光照条件下苗期干质量差异有统计学意义．不论是置于光照还是黑暗条件下，D3生长都是最为旺盛的，苗期总长和下胚轴长都显著高于野生型．通过对转基因植株苗期光照和黑暗条件下生长情况的统计，可以发现转基因植株根和下胚轴长一定程度上都高于野生型植株，而且D3表现最好．结合D3转基因株系DWF4基因较高的表达水平，显示DWF4基因表达较高者，其苗期根以及下胚轴生长速度会更快．

2.4 pCABarDWF4转基因芥菜植株生长情况分析

将pCABarDWF4转基因芥菜植株置于人工气候室内培养观察，从其整个生命周期中，转基因植株比野生型植株生长更加旺盛．在60 d时，转基因植株就已经比野生型植株长得更壮，其叶片伸展更开(图4a)．

到180 d时，转基因植株开始逐渐抽薹，而野生型植株还没有抽薹(图4c)．转基因植株最早开花时间比野生型植株提前一个多月．转基因植株和野生型植株花器官相比，转基因植株的花瓣较大(图4d)．对比转基因植株和野生型植株同时期的叶片，可以发现转基因植株叶片伸展更长、更宽，而且叶片颜色更加浓绿(图4b)．从图5中可以发现，随着时间的延长，转基因植株和野生型植株的株高、开展度、最大叶长和最大叶宽也随着增长，但是转基因植株生长明显快于野生型植株．转基因植株之间相比，D2和D3生长势明显好于D1．

图4 T2代pCABarDWF4转基因芥菜植株的形态学比较

D1，D2和D3为转基因植株，WT为野生型植株．

2.5 pCABarDWF4转基因芥菜植株结籽情况分析

进一步对转基因植株结荚结籽情况进行了调查．转基因植株枝条上比野生型植株结有更多的种子(图6a)，转基因植株果荚长度高于野生型植株果荚长度(图6b)，且转基因植株果荚结籽数更多(图6c和图6d)．

图6 T2代pCABarDWF4转基因芥菜植株结籽情况

从表3中可以看出，转基因植株主枝长度远远超过野生型植株．除D3外，主枝平均果荚数也超过了野生型，转基因植株主枝果荚长度和所结种子数均高于野生型．转基因植株一次分枝数和二次分枝数高于野生型，且一次分枝果荚数、一次分枝所结种子数和二次分枝果荚数、二次分枝所结种子数也都高于野生型．综合来看，转基因植株种荚率、全株总种荚数和所结总种子数均高于野生型植株．对千粒质量和籽粒密度测量数据来看，D1和D2超过野生型而D3与野生型基本一致．结果显示，在芥菜中超表达DWF4基因具有明显增加种子产量的作用．

表3 pCABarDWF4转基因芥菜T2代结种数调查统计

续表3

2.6 pCABarDWF4转基因芥菜植株BR生物合成结构基因

DET2，ROT3，CPD，CYP85A2等基因被认为参与了BR的生物合成．在pCABarDWF4转基因植株中，DWF4下游基因DET2在D2和D3株系中平均表达量是野生型的2倍，说明超表达DWF4基因促进了下游DET2基因的表达(图7a)．

DET2基因下游的ROT3基因在转基因植株中的平均表达量高出野生型植株的40%(图7b)．

CPD基因代谢油菜甾醇(campesterol)和其他中间产物，而DWF4基因也参与代谢油菜甾醇，DWF4基因与CPD基因可能存在竞争作用．在本实验中，pCABarDWF4转基因芥菜植株的CPD基因表达量都低于野生型，其平均表达量只达到野生型植株表达量的一半，说明DWF4基因与CPD基因表达呈负相关(图7c)．

D1，D2和D3为转基因植株，WT为野生型植株；小写字母不同表示p<0.05，差异有统计学意义．

CYP85A2是BR生物合成途径中的重要因子，在pCABarDWF4转基因芥菜植株中，他们的相对表达量都不同程度高于野生型，CYP85A2是在BR合成途径中最后一步反应的基因，说明转基因pCABarDWF4芥菜中，超表达DWF4基因促进了下游相关BR合成基因的表达，促进了BR的生物合成．

2.7 pCABarDWF4转基因芥菜植株BR转录调控相关基因表达分析

BR生物合成除了结构基因的表达外，还受到细胞内其他转录激活或者转录抑制基因的调控．

BAK1是一类重要的类受体蛋白，参与调控BR的合成，调节植物生长发育．在pCABarDWF4转基因植株中，BAK1基因表达量均比野生型植株表达量升高，且平均值高出近40%(图8a)．

BAS1基因表达被外源BR诱导，功能应该是维系内源BR的恒定水平，其羟化C26，影响植株体内BR量，是一个油菜素内酯失活基因．在本研究中，虽然转基因植株中BAS1的平均表达量0.95高于野生型植株表达量0.83，但随着DWF4基因表达水平上升，BAS1基因表达水平降低(图8b)．

D1，D2，D3为转基因植株，WT为野生型植株；小写字母不同表示p<0.05，差异有统计学意义．

BES1和BZR1是油菜素甾醇信号途径下游最重要的一类转录因子，参与油菜素甾醇合成转录的诱导和抑制调控．在本研究中，转基因株系中BES1和BZR1的平均表达量分别是野生型植株的2～3倍(图8c和图8d)，说明超表达DWF4基因导致细胞内BR积累水平上升后，引起BES1和BZR1基因表达水平上升，促进细胞内积累更多的BR．

BIN2在BR途径中起到调控BES1和BZR1的作用，在转基因植株中BIN2基因的平均表达量是野生型植株的2倍(图8e)，BES1和BZR1表达量较高，那么BIN2表达量应和这两个基因表达量相一致．

BSKs是一类参与油菜素内酯信号转导的植物特异受体类胞质激酶，参与BR信号转导途径，在转基因植株中其平均表达量高于野生型植株近50%(图8f)．

BAK1，BAS1，BES1，BZR1，BIN2，BSKs都参与了BR合成的转录调控，调节内源BR水平，在pCABarDWF4转基因芥菜植株中，随着DWF4基因表达水平的提高，大多数调控基因BAK1，BZR1，BIN2和BSKs的表达量与DWF4表达量呈正相关，出现明显上调．而维系细胞内内源BR稳定水平的BAS1基因，则在不同植株之间的表达水平变化小．

3 讨 论

3.1 DWF4基因超表达对芥菜生长发育的影响

DWF4编码C22羟基化酶，其转录水平受BR反馈抑制，其可以迅速而准确地对内源BR水平响应表达变化[11，14]，是BR合成关键基因之一．在拟南芥中，不论是光照还是黑暗条件下，通过超表达DWF4基因，拟南芥幼苗下胚轴长度远远高于对照野生型[2]，本实验中，在芥菜中超量表达DWF4基因后，与野生型相比，转基因苗期根茎伸长变快，与在拟南芥中的实验结果一致．在拟南芥和烟草中超表达DWF4基因，其成熟植株花序高度分别增加了35%和14%，与野生型相比，在拟南芥中超表达DWF4基因将增加近两倍的分枝数和结荚数，结子量升高[2]．而在本实验中，通过在芥菜中超表达DWF4基因，转基因芥菜所结种子数是野生型的近2.5倍，说明超表达DWF4基因可以大幅度促进植株产量提高．在拟南芥中超表达DWF4基因将使植株叶片叶柄伸长，开花时间提前，转基因植株生长更加旺盛[15]．在本文图4和图5中可以看出，芥菜超表达DWF4基因使植株株高、开展度、最大叶长和最大叶宽皆比同时期野生型增高，转基因植株抽薹开花时间提前．说明DWF4基因对植株生长发育有促进作用，因此增强了植株生长势，植株生长更加旺盛可能也与转基因植株产量提高息息相关．

3.2 DWF4基因超表达对BR合成调控途径相关基因表达的影响

DWF1诱导24-亚甲基胆甾醇(24-methylenecholesterol)转变为芸薹甾醇(Campesterol)[16]，是BR前期合成的重要基因．在本文中，超表达DWF4基因并没有太多影响DWF1基因的表达，可能是DWF1作用与DWF4基因上游有关．DET2，5-α还原酶被认为是油菜素内酯生物合成酶关键元件，其催化菜油甾醇转化为菜油甾烷醇，是油菜素内酯合成过程中催化较早反应的酶[17]．在本实验中，超表达DWF4基因促进了DET2的表达，特别是D2和D3植株，表达量超出了野生型植株约2倍，说明DWF4基因正调控DET2的表达．ROT3编码细胞色素P450(CYP90C1)，在叶和花的形成发展期间，与细胞极性伸长相关[18]，在BR生物合成途径中，ROT3与CYP90D1起着共同催化C23羟基化的作用[19]．在本实验中，ROT3表达量在转基因植株中表达较高，远远超过野生型植株，说明超量表达DWF4基因促进了ROT3基因的表达．有报道称CPD基因编码一种重要的BR合成酶(CYP90A1)，催化C23羟化反应，代谢油菜甾醇(campesterol)和其他中间产物，Ohnishi等[20]则发现CPD基因参与C3氧化反应．在本实验中，超表达DWF4基因使得CPD表达量降低，说明DWF4负调节CPD基因，这可能是DWF4基因和CPD基因具有相似性，在BR合成途径中作用位点有相同之处，因此两者产生了抑制作用．CYP85A2调节内源CS水平从而控制BR中C28和C27生物合成途径，在C6氧化途径中，CYP85A2比CYP85A1更加有活性，通过超表达和对两个基因突变体的观察研究也证实了此结论．在拟南芥中，CYP85A1对CYP85A2起到辅助作用促进BR合成[21]，在本实验中，超表达DWF4基因促进了CYP85A1和CYP85A2的表达，而且CYP85A2基因表达量升高更多，佐证了CYP85A2基因比CYP85A1基因活性更强、作用更强的结论，而CYP85A2基因是BR生物合成途径中最后一步反应的重要因子，因此CYP85A2基因表达量的升高证实转基因植株体内BR浓度水平的升高．所以，超表达DWF4基因促进了植株体内BR合成途径中的相关基因，促进了内源BR的生成．

BAK1编码一个由615个氨基酸组成的蛋白，是一个典型的受体激酶，其在植物体内广泛表达，参与调控BR信号[22]，在芥菜中超表达DWF4基因促进了BAK1的表达．BAS1编码一种C26羟化酶，催化CS和BL分别生成26-OH-CS和26-OH-BL，从而使BL功能失活，以维持体内活性BL的静态平衡，在内源BL含量高的组织器官中活跃表达[23]．但是在本实验中，超表达DWF4基因并没有显著提高BAS1的表达量，其中的内在机理还需进一步研究．核内蛋白BZR1和其同系物BES1是BR信号途径中的两个重要转录因子，被PP2A蛋白介导脱去磷酸化，去磷酸化后的BZR1和BES1在细胞核中调节将近1 000个靶基因，从而调节植物生长．ChIP-qPCR实验显示BZR1和BES1可以结合DWF4基因和BR诱导基因SAUR-AC1[24]．在本文中，BES1和BZR1两个基因在转基因植株中表达量远远高于野生型植株，说明超表达DWF4基因促进了转基因植株内源BR提高，因此BES1和BZR1基因转录水平升高从而维持植株体内BR平衡．BR结合BRI1感受器激活BIN2，调节植株生长，BIN2对BES1和BZR1这两个转录因子的磷酸化起着重要作用，是BR信号途径中重要的调控因子[25]．BIN2基因的表达应与BES1和BZR1基因表达相一致．在本文实验结果中，BIN2基因的表达与BZR1基因表达趋势基本一致，在转基因植株中表达量升高，这与理论结果相同．拟南芥质膜蛋白组学研究发现BR信号激酶BSKs，磷酸化的BSKs可以和BR受体激酶BRI1相互作用[26]．在图8中可以得知，超表达DWF4基因促进了BSKs的表达．综上所述，通过定量PCR[27]实验结果显示，超表达DWF4基因促进了植株内源BR水平的提高，因此维持体内BR平衡的BAK1，BAS1，BES1，BZR1，BIN2，BSKs基因都各有升高．