敲除MSTN基因可上调骨骼肌胰岛素信号通路并减轻2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗*

柳杨青， 汪艳芳

（河南省人民医院/郑州大学人民医院/河南大学人民医院 1编辑部，2内分泌科，河南郑州450003）

肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）是转化生长因子β 超家族成员之一，可显著抑制肌肉增生、肥大［1］。MSTN 除可负向调控骨骼肌质量外，在蛋白质、脂肪和糖代谢调节中也发挥重要作用。既往研究表明，2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）及胰岛素抵抗人群血清和骨骼肌中MSTN 水平升高［2］；T2DM 小鼠骨骼肌 MSTN 表达增加，接受 MSTN抗体注射后，空腹和餐后血糖水平降低［3］。推测MSTN可影响机体对葡萄糖的摄取和利用，参与胰岛素抵抗的发生。但迄今为止MSTN 参与调节T2DM胰岛素抵抗的分子机制尚不明确。本研究以MSTN基因敲除小鼠为基础，采用高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素注射构建T2DM 动物模型，探究MSTN基因对T2DM 小鼠胰岛素抵抗及骨骼肌胰岛素信号通路的影响，现报道如下。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物 采用CRISPR/Cas9 技术及高通量电转受精卵方式构建杂合型MSTN基因敲除（MSTN+/-）小鼠，通过繁育及PCR 鉴定获得纯合型MSTN基因敲除（MSTN-/-）小鼠 12 只，杂合型MSTN基因敲除（MSTN+/-）小鼠 12 只，野生型（wild type，WT）小鼠12只，品系C57BL/6N，6周龄，雄性，由赛业生物科技有限公司提供。小鼠饲养于河南大学医学院动物房［动物实验许可证号SYXK（豫）2016-0006］，室内温度22～24 ℃，湿度40%～60%，保持昼夜12 h 节律，自由进食饮水，适应性饲养1 周。本研究遵循动物伦理和实验准则。

1.2 主要仪器与试剂 抓力测定仪（上海欣软）；转棒式疲劳仪（安徽正华）；血糖仪（江苏鱼跃）；酶标仪（BioTeK）；脱水机、包埋机和病理切片机（武汉俊杰）；光学显微镜及成像系统（Nikon）；匀浆仪（Bio-Spec）；脱色摇床和电泳仪（北京六一）。链脲佐菌素（Sigma）；胰岛素酶联免疫试剂盒（Millipore）；兔抗小鼠胰岛素受体（insulin receptor，InsR）、葡萄糖转运体4（glucose transporter 4，GLUT4）、胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）和蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）抗体（武汉云克隆）；兔抗小鼠磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）抗体（武汉博奥森）；兔抗小鼠p-IRS1、p-PI3K、p-Akt、糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthetase kinase 3β，GSK3β）和p-GSK3β抗体（上海生工）。

2 方法

2.1 动物模型的建立与评价 将12 只WT 小鼠、12只MSTN+/-小鼠、12 只纯合型MSTN-/-小鼠各随机分为 2 组，每组 6 只，分别为：WT 组、MSTN+/-组、MSTN-/-组、WT+DM 组、MSTN+/-+DM 组和MSTN-/-+DM 组，前3 组给予普通饮食6 周，后3 组给予高脂饮食及链脲佐菌素腹腔注射6 周诱导T2DM 模型。WT+DM 组、MSTN+/-+DM 组和MSTN-/-+DM 组小鼠给予高脂饮食喂养6 周后，腹腔注射2%链脲佐菌素（35 mg/kg），72 h 后禁食6 h，检测空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）≥16.7 mmol/L 即可认为造模成功。18 只小鼠均造模成功。另外3 组小鼠腹腔注射等剂量柠檬酸缓冲液作为对照。普通饮食：总热量为3.85 kcal/g，糖类、脂肪、蛋白质分别占70%、10%、20%；高脂饮食：总热量为5.24 kcal/g，糖类、脂肪、蛋白质分别占20%、60%、20%。

2.2 体重、体长和腹围的测定 造模前及造模成功后，用电子秤测定小鼠体重，卷尺测定小鼠体长和腹围。

2.3 抓力和转棒力竭时间的测定 造模后测定小鼠抓力：将小鼠放置在抓力测定仪的抓具上，踩下脚踏开关，均匀用力向后拉小鼠，直至四肢均脱离抓具，软件自动记录抓力峰值。造模后测定小鼠转棒力竭时间：将小鼠放置在直径为3 cm 的转棒式疲劳仪的旋转杆上，转速设定为20 r/min，每次同时测定5只小鼠，每个隔室中1 只。小鼠按与转棒旋转方向相反的方式奔跑，当进入疲劳状态时即从转棒上跌落。记录小鼠从转棒开始旋转至掉落的时间，最大测定时间为10 min，每次休息20 min。同1 只小鼠连续测试抓力和力竭时间各3次，计算平均值。

2.4 胰岛素抵抗程度的评估 造模后小鼠禁食6 h，取尾静脉血，用血糖仪测定FPG，用ELISA 试剂盒测定空腹血清胰岛素（fasting serum insulin，FIns）并计算胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index，ISI）=ln［1（/FPG×FIns）］，稳态模型胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR）=（FPG×FIns）/22.5，严格按试剂盒说明书进行操作。葡萄糖耐量实验（glucose tolerance test，GTT）和胰岛素耐量实验（insulin tolerance test，ITT）：小鼠分别以2 g/kg葡萄糖灌胃或5 mL/kg胰岛素腹腔注射后，于 15、30、60 和 120 min 测取尾静脉血测血糖，记录血糖变化曲线并计算曲线下面积［AUC=（15×G0+30×G15+45×G30+90×G60+60×G120）/2］，其中 G0、G15、G30、G60 和 G120 表示空腹及各时点血糖。

2.5 动物处死与取材 以上实验完成后处死小鼠，迅速解剖出右下肢腓肠肌及腹股沟、附睾、肠系膜白色脂肪组织，吸取表面血液及体液，用电子秤称湿重，计算腓肠肌比重=右下肢腓肠肌质量/体重，白色脂肪比重=白色脂肪总质量/体重。称重后将腓肠肌一半保存于液氮中，另一半保存于甲醛固定液中。

2.6 腓肠肌HE 染色 将甲醛固定好的腓肠肌用乙醇和二甲苯脱水后制成蜡块并切片。依次进行脱蜡、苏木素染色、脱水、伊红染色、脱水、透明、封片。光学显微镜下采集图像，ImageJ 软件分析腓肠肌形态及细胞横截面积。

2.7 骨骼肌胰岛素信号通路相关蛋白水平的测定 取腓肠肌组织50 mg置于匀浆器，加入蛋白裂解液，反复多次匀浆以确保完全裂解。将匀浆液转移至离心管中，12 000 r/min离心10 min后留取上清液。BCA 法测蛋白浓度。进行SDS-PAGE，加入样品，电压60 V，电泳至溴酚蓝到达底部时停止电泳。加入含有甲醇的转移缓冲液，电压60 V 转膜2 h，湿转法将蛋白转移至 PVDF 膜。TBST 洗膜 10 min × 3 次。5%脱脂奶粉溶液封闭PVDF 膜1 h。加入TBST 稀释Ⅰ抗，4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜 10 min × 3 次。加入TBST 稀释Ⅱ抗，室温下孵育1 h，TBST 洗膜10 min ×3 次。ECL A、B 液等量混匀后加至 PVDF 膜，暗匣曝光，依次显影、定影。晾干，扫描胶片。以β-actin 为内参照，采用ImageJ软件分析目标条带的吸光度值。

3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据均经正态性检验，正态分布的计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 造模后小鼠体质量、体长、腹围和体成分的比较

造模前各组小鼠体重、体长和腹围的差异无统计学显著性（P＞0.05），见表1。造模后：WT+DM 组小鼠体重、腹围和腓肠肌比重小于WT 组，白色脂肪比重大于WT 组（P＜0.05）；MSTN-/-组小鼠体重大于WT 组（P＜0.05），体长、腹围、腓肠肌比重大于WT组、MSTN+/-组（P＜0.05），白色脂肪比重与 WT 组、MSTN+/-组比较差异无统计学显著性（P＞0.05）；MSTN-/-+DM 组体重、体长、腹围和腓肠肌比重大于WT+DM 组 ，白色 脂肪比 重 小于 WT+DM 组（P＜0.05），见表1、2。

表1 造模前后小鼠体重、体长和腹围的比较Table 1. BM，BL and AC of mice before and after modeling（Mean±SD. n=6）

2 造模后小鼠抓力和转棒力竭时间的比较

DM 模型后，小鼠的抓力和转棒力竭时间均小于相应的正常饮食小鼠（P＜0.05）；WT+DM组的抓力和转棒力竭时间小于WT 组（P＜0.05）；MSTN-/-组抓力大于WT 组（P＜0.05），MSTN-/-+DM 组抓力大于WT+DM组（P＜0.05）。见表3。

3 造模后小鼠胰岛素抵抗程度的比较

WT+DM 组 FPG、HOMA-IR、GTT-AUC 和 ITTAUC 高于 WT 组，FIns 和 ISI 低于 WT 组（P＜0.05）；MSTN-/-组 GTT-AUC 低 于 WT 组 、MSTN+/-组（P＜0.05），ITT-AUC 高于 WT 组和MSTN+/-组（P＜0.05），FPG、FIns、ISI 和 HOMA-IR 与 WT 组和MSTN+/-组比较差异无统计学显著性（P＞0.05）；MSTN-/-+DM 组ISI 高于 WT+DM 组（P＜0.05），HOMA-IR、GTT-AUC和ITT-AUC低于WT+DM组（P＜0.05），见图1、表3。

表3 造模后小鼠抓力、转棒力竭时间和胰岛素抵抗程度的比较Table 3. Gripping force，rotating time and insulin resistance of mice after modeling（Mean±SD. n=6）

4 造模后小鼠腓肠肌细胞形态的变化及横截面积的比较

WT 组肌细胞排列规则，细胞完整，无萎缩、水肿、坏死，WT+DM 组肌细胞排列松散，肌纤维萎缩，边缘角化，细胞横截面积明显小于WT 组（P＜0.05）。WT 组、MSTN+/-组和MSTN-/-组小鼠腓肠肌细胞体积逐渐增大，MSTN-/-组肌细胞排列紧密，边缘圆润，细胞间隙明显缩小，细胞横截面积明显大于WT 组（P＜0.05）。MSTN-/-+DM 组腓肠肌细胞横截面积明显大于 WT+DM 组（P＜0.05），形 态 接 近 WT 组 ，见图2、3。

表2 造模后小鼠体成分的比较Table 2. Body mass composition of the mice after modeling（Mean±SD. n=6）

Figure 1. GTT（A）and ITT（B）of the mice after modeling. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs WT group；#P＜0.05 vs MSTN+/- group；&P＜0.05 vs MSTN-/-group；+P＜0.05 vs WT+DM group；△P＜0.05 vs MSTN+/-+DM group.图1 造模后小鼠GTT及ITT

Figure 2. HE staining of gastrocnemius tissue in the mice（scale bar=100 μm）.图2 造模后小鼠腓肠肌HE染色

Figure 3. Cross-sectional area of gastrocnemius fibers in the mice after modeling. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs WT group；#P＜0.05 vs MSTN+/- group；&P＜0.05 vs MSTN-/- group；+P＜0.05 vs WT+DM group；△P＜0.05 vs MSTN+/-+DM group.图3 造模后小鼠腓肠肌细胞横截面积的比较

5 造模后小鼠骨骼肌胰岛素信号通路相关蛋白水平的比较

WT+DM 组 InsR 和 GLUT4 蛋 白 水 平 及 IRS1、PI3K、Akt 和 GSK3β 磷酸化比例低于 WT 组（P＜0.05）；MSTN-/-组 GLUT4 蛋白水平及 PI3K、Akt 和GSK3β 磷酸化比例高于 WT 组（P＜0.05）；MSTN-/-+DM 组的 InsR 和 GLUT4 蛋白水平及 IRS1、PI3K、Akt和GSK3β 的磷酸化比例高于WT+DM 组（P＜0.05），见图4。

讨 论

研究发现，MSTN基因敲除小鼠肌肉质量增加，脂肪质量减少，可抵抗高脂饮食诱导的肥胖［4-6］。本研究结果显示，造模前MSTN-/-组小鼠体重、体长、腹围略大于WT 组，但差异无统计学显著性，可能与小鼠周龄较小，MSTN基因敲除后变化不明显有关；造模后MSTN-/-组小鼠较WT 组体重、体长和腹围明显增大，腓肠肌比重及肌细胞横截面积明显增加，表明MSTN可负向调节骨骼肌质量和体积，抑制肌肉肥大。白色脂肪堆积是T2DM 的显著特征之一，与代谢综合征、胰岛素抵抗关系密切［7］。本研究结果显示，WT+DM 组小鼠腓肠肌比重明显减小，白色脂肪比重明显增多，而MSTN-/-+DM 组较WT+DM 组有明显改善，表明抑制MSTN表达可在一定程度上拮抗T2DM 引起的肌量减少，白色脂肪堆积，改善体成分分布。

研究显示，MSTN基因敲除可增强小鼠的骨骼肌力量，缩短跑台运动及游泳疲劳时间［8-9］。本研究采用抓力和转棒力竭时间评价小鼠肌力及抗疲劳能力，结果显示，MSTN-/-组小鼠抓力较野生型显著增强，表明MSTN负向调控肌量的同时，也对肌力产生负性影响。MSTN-/-+DM 组小鼠抓力较WT+DM 组显著提高，甚至接近WT 组水平，提示抑制MSTN表达可拮抗T2DM 引起的肌力减弱。而MSTN基因敲除小鼠转棒力竭时间却无明显变化，因此尚不能确定MSTN对抗疲劳能力的影响。

目前普遍认为胰岛素抵抗是糖尿病、肥胖、脂代谢异常等疾病的共同发病基础。胰岛素-胰岛素受体-胰岛素受体底物-磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B-葡萄糖转运体4/糖原合成酶激酶3β 信号通路是胰岛素介导葡萄糖摄取和转运的重要途径，通路中任一分子异常均可能影响骨骼肌对葡萄糖的转运和利用，引起糖耐量受损和胰岛素抵抗［10-12］。既往研究［2-3，13］发现，MSTN 可能影响机体对葡萄糖的摄取利用，参与胰岛素抵抗的发生；抑制MSTN 表达可促进高脂饮食喂养肥胖小鼠葡萄糖代谢。本研究结果显示，纯合型小鼠较杂合型及野生型小鼠糖耐量明显改善，胰岛素敏感性增强，骨骼肌胰岛素信号通路各蛋白表达水平及磷酸化比例增加，表明MSTN基因表达缺失可上调胰岛素信号通路，促进葡萄糖转运及糖原合成，增强血糖调控能力，改善胰岛素抵抗，拮抗T2DM对糖代谢的负性影响。本研究腓肠肌HE染色结果显示，MSTN-/-组、MSTN-/-+DM 组小鼠腓肠肌纤维明显增粗，推测骨骼肌形态特性改变致其细胞膜InsR 和GLUT4 等受体增多，胰岛素信号通路传导增强，葡萄糖转运和糖原合成加快，导致胰岛素敏感性增强，胰岛素抵抗减轻。

肌少症是与增龄有关的以进行性肌量减少和（或）肌强度下降或肌肉功能减退为特征的疾病。中年男性和女性血清MSTN水平均高于年轻组，肌肉质量与血清MSTN水平呈负相关［14-15］，握力水平较高的老年男性血清MSTN水平较低［16］，而握力是反映肌肉力量的重要指标，提示MSTN与肌少症有关。T2DM 患者往往早期就可出现肌肉质量减少和肌肉功能减退，可能与代谢异常、炎症通路激活、激素变化等多种机制有关。横断面调查显示，北京地区60岁以上T2DM 患者肌少症患病率为8.5%［17］。T2DM合并肌少症人群中同时存在胰岛素抵抗与肌量减少、肌力减弱，而骨骼肌是摄取利用葡萄糖的主要靶器官，因此肌少症可对全身葡萄糖代谢产生巨大影响。本研究结果显示，T2DM 小鼠较野生型小鼠肌肉质量明显减少，肌力明显减弱，胰岛素敏感性降低，胰岛素抵抗增加，而抑制MSTN表达可在一定程度上减轻T2DM 对肌量、肌力、糖调节能力的负性影响。目前对于T2DM 合并肌少症这一疾病还缺乏有效的治疗手段，而本研究通过动物实验证实，抑制MSTN的表达不仅可有效提高肌量和肌力，还可通过上调胰岛素信号通路在一定程度上改善机体的胰岛素抵抗，为T2DM合并肌少症的治疗提供新思路。

Figure 4. Protein expression on insulin signaling pathway in skeletal muscle of the mice after modeling. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs WT group；#P＜0.05 vs MSTN+/- group；&P＜0.05 vs MSTN-/- group；+P＜0.05 vs WT+DM group；△P＜0.05 vs MSTN+/-+DM group.图4 造模后小鼠骨骼肌胰岛素信号通路相关蛋白水平的比较

本研究结果提示，抑制MSTN 表达可引起肌量、肌力增加以及肌细胞肥大，上调胰岛素信号通路，减轻胰岛素抵抗；可在一定程度上拮抗T2DM 对肌量、肌力及胰岛素信号通路的负性影响，改善糖耐量及胰岛素抵抗。但本研究为动物实验，样本量较小，结论有一定局限性，MSTN基因参与T2DM 胰岛素抵抗的机制需进一步深入研究。