双氢青蒿素抗肿瘤作用机制研究进展*

唐恬，曹祺，夏庆杰

610041 成都，.四川大学华西第二医院 妇产科生殖医学科(唐恬、曹祺);出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室(四川大学) (唐恬、曹祺)； 610041 成都，四川大学华西医院转化神经中心 神经疾病研究室(夏庆杰)

双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是中药青蒿素的一个重要半合成衍生物，能作用于红细胞内期的疟原虫超微结构，达到抗疟疾的效用。研究表明，DHA除了具有抗疟作用外，还对多种肿瘤细胞系具有杀伤作用，包括腺癌(乳腺癌，结肠癌等)，上皮源性肿瘤(卵巢癌及前列腺癌等)，并且它以剂量和时间依赖性方式诱导氧自由基损伤、抑制细胞生长，同时诱导细胞凋亡、调低肿瘤细胞增殖生长、转移侵袭等信号转导途径[1]。研究显示DHA对癌细胞发挥杀伤作用的机制包括增强氧化应激反应，影响DNA损伤和修复，诱导细胞死亡(细胞凋亡、自噬、坏死、凋亡)，抑制血管生成及调控肿瘤相关的信号转导途径[2]。恶性肿瘤耐药与复发严重威胁人类生命健康。尽管目前恶性肿瘤的诊断和治疗取得了重要进步，但化疗耐药的现象已成为治疗失败和复发的重要因素，如何有效突破耐药瓶颈是目前提高肿瘤治疗有效率及改善患者预后的当务之急。于是，寻求高效低毒的抗肿瘤药物已成为肿瘤研究亟需解决的难题。本文将对DHA在抗肿瘤中的重要作用及机制进行综述。

1 DHA影响铁代谢和产生氧自由基杀伤肿瘤细胞

DHA可以通过影响铁代谢和活性氧簇实现抗肿瘤效用[3]。细胞增殖需要铁离子，肿瘤细胞需要大量亚铁离子用于DNA合成从而满足肿瘤细胞的高速生长。因此，肿瘤细胞内Fe2+的含量也比正常细胞明显更高。DHA的过氧化桥结构与肿瘤细胞内亚铁离子反应后断裂，可产生以碳为核心的自由基或ROS[4]。这些氧自由基将氧化修饰肿瘤细胞生存、增殖所必需的蛋白质、脂类等大分子物质、干扰肿瘤细胞内的信号传导，从而降低肿瘤细胞增殖率、诱导肿瘤细胞凋亡、程序性坏死，最终达到抗肿瘤效用[5]。

多项研究表明，转铁蛋白受体 (transferrin receptor，TfR) 在肿瘤细胞(肺癌、胰腺癌、直肠癌、膀胱癌等)内高表达[6]。正常组织及细胞内的的TfR表达非常低，仅有肝细胞、表皮细胞等少量表达[6]。借由与TfR形成共价复合物，依赖铁离子的DHA能对肿瘤细胞实现靶向性杀伤[7]。正常细胞内还原性物质较少，即使有铁离子存在也并非具有催化活性的亚铁离子，不能与DHA的过氧化桥结构反应[7]。因此，DHA的细胞毒性主要靶向杀伤肿瘤细胞而非正常细胞。 由此，DHA能够较为特异地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞组织的毒副作用较小。

目前基于DHA通过Fe2+离子反应产生活性氧抗肿瘤的机制，人们进一步提出了“铁死亡”概念[8]。“铁死亡”是由铁依赖性脂质活性氧积累和质膜多不饱和脂肪酸消耗引起的程序性细胞死亡。研究发现，DHA处理头颈部鳞状细胞癌 (head neck squamous cell carcinoma,HNSCC) 时，观察到典型的“铁死亡”线粒体形态改变，同时活性氧水平升高，但这种升高能被铁螯合剂抑制，且在DHA处理的HNSCC细胞中观察到“铁死亡”重要调节因子GPx4和Ras的水平下降[8]。进一步的研究发现，动物模型口服低剂量的Fe2+溶液显著增强DHA抗肿瘤作用，即在DHA治疗前，预加入铁剂或过表达转铁蛋白，增加癌细胞内的亚铁含量，将起到强化DHA杀伤肿瘤细胞的效用[2,8]。

2 DHA抑制肿瘤细胞生长

2.1 DHA阻滞细胞周期

DHA能通过阻断肿瘤细胞周期起到抗肿瘤效果。研究显示，DHA作用于乳腺癌MCF-7细胞后，经细胞周期分析显示，MCF-7细胞不能顺利从G0和G1期进入S期[9]。在一项胰腺癌细胞系的研究中发现，DHA治疗影响细胞周期调节酶的表达(如cyclin E、CDK2、CDK4和p27)，DHA下调cyclin E蛋白水平，同时调低cdk2的表达，继而减少cyclin E1蛋白与cdk2的结合，影响肿瘤细胞的G1/S转换，最终导致剂量依赖性G0/G1细胞周期阻滞[9-10]。最近的一项研究表明，DHA同样可以导致人胃癌细胞系 (SGC-7901, MGC-803) G0/G1细胞周期阻滞, 并可能通过cyclin D1-CDK4-Rb信号通路发挥上述作用[11]。更多类似研究表明，NCI-H1975细胞系(人非小细胞肺癌细胞系)细胞增殖被DHA显著抑制，肿瘤细胞被阻滞于G2期[12]。DHA能降低cyclin B1的表达，使得G2/M期cyclin B1蛋白的合成较少，不足以与Cdc2结合产生成熟促进因子 (maturation-promoting factor, MPF)，而MPF是驱动细胞从G2期到M期的一个重要因素[13]。以上研究均表明DHA可能影响肿瘤细胞周期转化，使肿瘤细胞发生周期阻滞，不能有效进行有丝分裂，从而起到抗肿瘤效果。

2.2 DHA诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡能力的减弱甚至丧失是癌症产生的重要原因，细胞增殖与凋亡调控紊乱是肿瘤细胞迅速生长与扩散转移的重要机制。在肿瘤治疗研究中发现，通过激活线粒体依赖途径或诱导死亡配体与受体结合等，可以达到治疗肿瘤的目的[14]。由此可见，关注肿瘤细胞凋亡相关信号通路在耐药肿瘤治疗中尤为重要。

2.2.1 DHA激活线粒体依赖性细胞凋亡通路 当受到化疗药物等凋亡信号刺激时，线粒体膜通透性就会发生改变，线粒体膜电位变化导致细胞色素C外漏，细胞质同时释放多种凋亡相关因子，从而触发caspase和其他的细胞死亡受体[15]。DHA能使线粒体跨膜电位(ΔΨm)丧失，下调Bcl-2同时上调Bax，加速线粒体膜去极化，改变线粒体通透性，加强Cyt C释放、Caspase-3、Caspase-9活化诱导瘤细胞凋亡，而Bcl-2转染后肿瘤细胞对DHA具有更强的耐药性[16-17]。研究同时发现DHA能使内质网应激途径关键蛋白GRP78、CHOP和eIF2α的表达升高，诱导Caspase-12的活化[18-19]。

2.2.2 DHA激活外源性凋亡通路 外源性凋亡通路起始于死亡受体，死亡受体受到刺激继而引起Caspase链级激活。死亡受体主要包括Fas、TNF、DR3、DR4、DR5等受体，它们能够被肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体结合激活，从而激活启动型Caspase引发Caspase级联反应，然后通过活化的执行型Caspase裂解特异性底物导致细胞凋亡[20]。根据细胞模型显示，DHA可上调Fas/CD95表达，导致线粒体膜电位分解、Cyt C释放、最终激活caspase3/9，起到驱动外源性Fas受体相关凋亡途径的作用[21]。

值得关注的是，当前在临床实践中肿瘤细胞对多种凋亡诱导药物可能产生耐药性，是治疗肿瘤失败的一大主要原因，而体外研究发现DHA与包括顺铂、达沙替尼以及长春新碱在内的多种抗肿瘤药物具有良好的协同增效作用，而更为重要的是DHA还能诱导上述药物耐药细胞的凋亡，从而起到逆转耐药的效果[22]。

以上研究均表明，DHA能通过内源及外源机制共同作用诱导肿瘤细胞程序性死亡——凋亡。

2.3 DHA诱导肿瘤细胞自噬

细胞自噬机制在肿瘤发生、发展以及清除癌变细胞两方面担当了“双刃剑”角色：一方面，自噬能在遭遇不利环境时提高肿瘤细胞对应激的耐受能力，维持其生存；另一方面，自噬又能在肿瘤发生发展的不同阶段抑制其进展，以致诱导某些化疗耐药的凋亡缺陷肿瘤细胞死亡[21-22]。研究提示，DHA主要通过抑制肿瘤细胞内NF-κB通路，阻滞p65的核转位，进而上调ROS水平，引起线粒体功能障碍，最终导致载铁肿瘤细胞系自噬[23-25]。另有研究提示，DHA新型衍生物DHA-37在人肺癌A549细胞系中通过上调高迁移率族蛋白1，诱导细胞自噬性死亡[26]。以上研究均提示DHA通过诱导自噬杀伤凋亡缺陷肿瘤细胞。

3 DHA抑制肿瘤细胞侵袭转移

肿瘤细胞向局部侵犯是侵袭的一种形式。而肿瘤细胞侵入血管或淋巴管或体腔，进而被带到另一部位或器官，在远处发生发展，形成与原病灶同源的肿物，是肿瘤侵袭的另一种表现形式[27]。恶性肿瘤转移将严重影响患者预后[27-28]。癌细胞的侵袭转移主要与癌细胞的运动因子、细胞粘附分子、细胞外基质分解酶、血管形成因子、细胞跨膜信号转导等因素有着密切联系[5,27]。

3.1 DHA抑制肿瘤血管生成

DHA抗肿瘤作用特点是其对肿瘤细胞的毒性作用远大于对正常细胞组织的毒性作用；DHA对不同肿瘤细胞的作用强弱亦不同，即具有选择性细胞毒作用[27-28]。肿瘤血管是肿瘤营养供应的基本条件。癌细胞能分泌血管生长因子，譬如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等特异蛋白[29]。血管生长因子不断刺激产生肿瘤血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VEC)，这些因子能促进肿瘤微环境内血管生成，为癌细胞生长提供养料，同时为肿瘤转移提供条件[28]。DHA通过降低肿瘤细胞VEGF表达，阻断VEGF与血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)作用，干扰VEC形成，最终抑制肿瘤转移[27]。由此可见，DHA抑制VEC生成是DHA制约肿瘤发展的关键限速步骤[27]。足量DHA可明显抑制肝肿瘤模型鼠瘤体组织及血清中的VEGF及VEGFR-2的表达，缩瘤效果明显，并使模型鼠的生存时间获益明显，由此可见，DHA能通过有效抑制肝肿瘤血管生成，延缓肿瘤的生长和转移[30]。类似研究指出，DHA通过抑制NF-κB/HIF-1α活性，激活IκB，调低VEGF/VEGFR-2的表达，抑制人脐静脉内皮细胞血管化生，从而抑制VEC增殖、诱导其走向凋亡，发挥逆转肿瘤新生血管功能[31]。DHA抑制食管癌细胞Eca109内NF-κB/VEGF通路后，肿瘤化疗敏感性相应增强，肿瘤细胞受到抑制，裸鼠成瘤模型内肿瘤生长缓慢[32]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是跨膜酪氨酸激酶受体家族的成员，在人类癌症中广泛表达[32]。EGFR在与相应的配体结合后自磷酸化，并激活对细胞增殖、血管生成和肿瘤干细胞富集等诸多过程至关重要的下游信号通路[33-34]。然而其在宫颈癌耐药及DHA增敏作用中的表达及调控机制尚不明确[35]。本团队前期预实验结果显示DHA能够影响CSCs富集及EGFR的表达，但其具体调控机制尚未得到充分证实，这点将受到本课题组的持续关注。

3.2 DHA抑制癌细胞侵袭及转移

DHA能调控肿瘤侵袭相关的信号转导途径(如MAPKs途径，EMT途径)[35]。研究表明，肿瘤溶解外基质向外侵袭和转移,在此过程中基质金属蛋白酶(matrix matalloproteinases,MMPs)是重要调控分子，MMPs能降解基底膜和基质、促进侵袭转移[34-35]。DHA能抑制MMPs表达从而抑制神经胶质瘤细胞的侵袭与转移[36]。MAPKs调控细胞外基质降解，从而诱导肿瘤细胞的侵袭转移[37]。DHA一方面抑制PKCα/MAPKs通路，另一方面降调AP-1蛋白，最终共同降低MMP-9的蛋白水平，抑制肿瘤细胞转移[38]。在人纤维肉瘤细胞中，DHA可通过抑制MAPKs家族所含的Jun/Fos等关键转录因子来抑制肿瘤细胞转移[38-39]。上皮细胞向间质细胞转变(epithelial to mesenchymal transition,EMT)的能力是评估上皮源性肿瘤细胞转移能力的重要指标[38-39]。EMT发生时，上皮肿瘤细胞极性丧失，间质细胞特性被剥夺，随之而来的是肿瘤细胞迁徙运动能力增强，易于穿过细胞基底膜[39]。DHA治疗上皮源性卵巢癌及前列腺癌细胞后，上皮组织标志钙粘附蛋白E表达增多，间质组织标志(波形蛋白等)表达减少，卵巢癌及前列腺癌细胞EMT被显著抑制，肿瘤细胞的侵袭和转移能力显著降低[40]。

4 DHA逆转肿瘤细胞耐药

在当前的肿瘤治疗中，肿瘤的耐药与复发问题尤为棘手。尽管目前诊断和治疗方面取得了重要进步，但化疗耐药的现象已成为肿瘤治疗失败和复发的重要因素。肿瘤的耐药机制十分复杂，主要涉及ABC转运蛋白超家族对抗肿瘤药物由内到外的转运、体内酶系统的异常、肿瘤干细胞、肿瘤细胞凋亡及自噬异常等[41-42]。针对肿瘤耐药的复杂机制，DHA可以通过多种方式发挥其逆转耐药的作用。DHA可以通过下调ATP结合盒亚族G成员2(ATP binding cassette subfamily G member 2,ABCG2)的转录翻译，并与P-糖蛋白竞争性结合，减少抗肿瘤药物的外排[43-44]。此外，如前所述，DHA还可以诱导肿瘤细胞凋亡，调节肿瘤细胞自噬，并由此在一定程度上逆转肿瘤耐药[22-25]。笔者课题组前期实验也已经证明DHA能够有效抑制紫杉醇耐药的子宫内膜癌细胞、宫颈癌细胞增殖并增加其凋亡水平[29,31]。

5 展 望

化疗耐药是影响肿瘤治疗有效率和反应率以及总体生存率的主要原因，目前已经成为困扰恶性肿瘤治疗的一大难题[45]。化疗耐药可能涉及到细胞凋亡等多种途径的失调。敏感肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞之间的比较表明，化疗耐药可能是多种相关机制相互作用的结果[46]。从天然产物中寻找可用的高效低毒的抗肿瘤活性成分及相应分子靶点是当前抗肿瘤药物研究的重要发展战略之一[47]。研究者对DHA这一天然产物衍生物进行了长时间的研究，积累了大量的数据。笔者长期致力于DHA抗肿瘤机制的研究，笔者认为：1)DHA通过凋亡、自噬共同作用，杀伤肿瘤细胞。然而这种杀伤作用在笔者的前期工作中被证实可以被si-TfR逆转。这提示我们DHA肿瘤杀伤作用有较大的铁依赖性；2)笔者在前期工作中发现DHA通过上调微管相关蛋白1轻链3-II/I(microtubule-associated protein 1 light chain 3-II/I,LC3-II/I)，下调选择性自噬蛋白P62，逆转肿瘤细胞对顺铂类药物的耐药性，增加铂类药物的抗肿瘤能力；3)笔者前期工作中还发现DHA能显著下调MAPKs家族的关键基因Jun/Fos，抑制耐药癌细胞的增殖，同时耐药癌细胞外泌体LncRNA HEIH的表达也显著下调；而在内膜癌细胞中，敲低LncRNA HEIH能明显下调MAPKs，并改善肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。这提示我们DHA可能通过LncRNAHEIH调控MAPKs，来改善肿瘤细胞的耐药性。

DHA的抗肿瘤机制仍不完全清晰，通过进一步探究DHA抗肿瘤机制，将使其具有更广阔的应用前景，同时研究DHA新适应症并应用于临床实践也将是今后的发展方向。

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