猪源性肺炎克雷伯菌对喹诺酮类抗生素耐药机制研究

郑静铃 漳州市云霄县东厦镇畜牧兽医站 福建漳州 363300

肺炎克雷伯菌是重要的人畜共患条件致病菌，被认为是抗生素耐药性传播的关键[1-3]。喹诺酮类抗生素是养殖上运用广泛的一类抗菌药物[4]。由于过度使用，对喹诺酮类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌不断增加[3]。本研究通过分离规模化养猪场、大型农贸市场以及农贸市场周边社区的肺炎克雷伯菌，了解喹诺酮类抗生素耐药现状，并进一步检测喹诺酮类抗生素耐药基因，旨在探讨猪源性肺炎克雷伯菌在喹诺酮类抗生素的耐药表型与耐药基因型的相关性，为养猪业临床了解肺炎克雷伯菌耐药性的发生及传播提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 20 株喹诺酮类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌，均分离自福建省内规模化猪场。

1.2 试验方法

1.2.1 PCR 鉴定与扩增 用PCR 法筛查20 株喹诺酮类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌耐药基因携带情况[5-6]。检测基因分别为质粒介导的qnrS 基因，aac(6′)-Ib 基因和oqxA/B 外排系统[7]，以及由染色体介导的gyrA/B 和parC/E 基因[8]。

1.2.2 测序及序列分析 对携带gyrA/B 和parC/E基因的菌株，取有目的条带的PCR 产物外送测序。于NCBI 上下载gyrA/B 和parC/E 基因序列，采用SnapGene 3.2.1 软件对基因突变位点进行分析[9]。

2 结果与分析

2.1 PCR 鉴定结果 用特异性引物对喹诺酮类耐药的肺炎克雷伯菌进行gyrA/B、parC/E、qnrS、aac(6′)-Ib 和oqxA/B 的PCR 鉴定。本试验检测出gyrA 突变，而未测到gyrB、parE 和parC 突变。gyrA 扩增出814 bp 的条带，分离率40.0%（8/20）；qnrS 扩增出492 bp 的条带，分离率35%（7/20）；aac(6′)-Ib 扩增出481 bp 的条带，分离率30%（6/20）；oqxA/B 扩增出310 bp 和513 bp 的条带，分离率分别为45%（9/20）、40%（8/20）。

2.2 gyrA/B 和parC/E 基因序列突变分析 gyrA83位丝氨酸突变检出率为40%（8/20），其中gyrA83 位丝氨酸突变成为了亮氨酸、异亮氨酸和酪氨酸，检出率分别为30%（6/20）、5%（1/20）和5%（1/20）。gyrA87 位天冬氨酸的突变检出率25%（5/20），分别突变为天冬酰胺和丙氨酸，检出率分别为20%（4/20）和5%（1/20），见表1。说明gyrA 突变是肺炎克雷伯菌产生喹诺酮类耐药的重要机制。

表1 gyrA/B 和parC/E 基因序列突变情况

2.3 质粒介导的喹诺酮类耐药基因检出情况 在12 株未发生gyrA 突变的喹诺酮类抗生素耐药肺炎克雷伯菌中，检测出9 株菌分别携带数种质粒介导的喹诺酮类耐药基因。aac(6′)-Ib 检出率为50%（6/12），qnrS 检出率为58%（7/12），oqxA/B 检出率分别为75%（9/12）和67%（8/12），见表2。说明质粒介导的喹诺酮类抗性基因在单独作用时也能使细菌产生高水平耐药。

表2 质粒介导的喹诺酮类耐药基因检出情况

3 结论

规模化养猪场、农贸市场以及农贸市场周边社区构成了肺炎克雷伯菌传播链，在该传播链中分离的肺炎克雷伯菌都是与猪场相关联的[10]。猪源性肺炎克雷伯菌对喹诺酮类抗生素耐药的主因是由染色体介导的gyrA 基因突变所致。未发生gyrA 突变的耐药菌检出携带质粒介导的喹诺酮类耐药基因，说明质粒介导的喹诺酮类耐药基因作用于菌株时也能产生不同程度耐药。