机械牵张促进干细胞衍生心肌样细胞进一步成熟的研究进展

古兴旺 周帆 穆军升

(1.首都医科大学，北京100069； 2.中国人民解放军总医院第三医学中心超声科，北京100039； 3.北京市安贞医院心外科，北京100029)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)发生后，梗死的心肌将逐渐由纤维组织代替，并永久地造成心功能下降，而干细胞由于其多向分化潜能，在组织修复重生方面有着巨大的潜能。因此，将干细胞疗法应用于MI来逆转下降的心功能，是一条前景可观的思路。早期尝试直接心肌内和静脉内注射干细胞等方式有一定疗效[1-2]，但其弊端在于过低的干细胞生存率[3]和心肌组织处的低停留率[4]，所以借用心肌补片等心脏组织工程技术[5]，并结合一些方式促进其预先向心肌细胞分化，可在一定程度上应对这些问题。在这方面，一般选择全能干细胞和多能干细胞，如胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)和脂肪干细胞(adipose stem cell，ASCs)等。而由于应用ESCs存在的伦理和免疫排斥问题[6-7]，研究方向已转向以多能干细胞为主[8-10]，其中，ASCs分化为心肌细胞的潜能可能要高于BMMSCs[11]。既往已有多种方法可促进干细胞分化为有功能的心肌样细胞，即干细胞衍生心肌样细胞(stem cell-derived cardiomyocytes，SCCMs)，然而研究表明，此种心肌细胞主要为幼稚型，其在形态、结构和功能方面类似于原生心肌细胞发育的早期阶段[12]，很难进一步应用于临床治疗MI等疾病。因此，如何提高其成熟度来达到临床应用的要求便成了目前亟待解决的问题。在目前被探索的多种方法中，机械牵张作为心肌细胞受到的主要机械刺激之一，被认为在这方面具有较大的潜能，但以往尚无对机械牵张研究的单独梳理，现从机械牵张的参数、机械牵张对SC-CMs成熟的影响和可能存在的信号转导机制等方面对相关研究现状进行综述。

1 促进SC-MCs成熟的机械牵张参数

体内搏动的心脏不断受到回心血流充盈心腔所致的前负荷和心脏射血时主要来自主动脉压的后负荷，机械牵张主要通过模拟正常心肌细胞受到的前负荷来促进SC-CMs的进一步成熟。牵张的施加方式多种多样，最主要的原理是将工程化组织两端分别固定在机械臂上，由一端可移动的机械臂控制牵张的幅度和频率，也有基于磁力和气压控制等的牵张力施加设备[13-14]，由于种类和型号繁多且均能按设定的参数施加牵张力，也无不同设备间区别的相关研究，现不展开讨论。牵张刺激的参数可分为牵张轴向、牵张幅度(以细胞被拉长的比例计算)、牵张频率和牵张时间等。在牵张轴向上，尽管在研究机械牵张促进干细胞分化为SC-CMs时还有双轴、多轴和等轴等多种方式[15-17]，但在促进SC-CMs进一步成熟时，单轴牵张仍是更主流的选择[14，18-19]，且少有研究去探索轴向区别所造成的影响。牵张幅度方面，虽然Girão-Silva等[16]发现12%拉伸度未能诱导人ASCs中心血管标志物的表达，间充质细胞表面标志物(CD29和CD90)也保持不变，但他们说明以前有实验证明10%甚至以上的牵张幅度可促进ASCs向心肌分化；其他众多学者的研究表明，10%左右的牵拉程度可促进SC-CMs在心肌标志物和肌节发育等方面的成熟[13，15，17，20-21]，Huang等[22]通过对照实验发现10%可能为最佳的牵张幅度，这可能与其接近生理状态有关。在牵张频率方面，Zhang等[21]和Ruan等[23]通过静态(0 Hz)和循环(非0 Hz)牵张的对照实验，肯定了后者的效果。为模拟正常的心脏搏动，循环牵张的频率基本被选定为1 Hz，Huang等[22]进一步指出1 Hz或1.5 Hz的循环牵张可诱导干细胞表达心肌细胞相关基因，且1 Hz可能最为合适。另外，Morgan等[24]发现相比固定的频率(1 Hz)，动态变化的牵张频率对新生小鼠心肌细胞的细胞间偶连有所影响，但收缩功能在两组间无明显区别。牵张时间在大多数实验中为1～7 d，也有学者将其细分至每天有固定的拉伸时间(如0.5 h/d)[19，25]，但和牵张轴向一样，其和施加全天候牵张力的区别并未被研究。综上所述，一组参数为10%、1 Hz和1～7 d(全天候)的单轴机械牵张可被视作较为通用的选择。

2 机械牵张对SC-CMs成熟的影响

现今，研究者们已探寻出许多可促进SC-CMs分化成熟的策略，如长程培养、共培养、3D培养和电学刺激等，机械刺激也是其中重要的一员，主要包括流体剪切力和机械牵张等[26]。机械牵张(模拟前负荷)作为心脏组织接受的主要机械刺激之一，已被多个研究证明可有效促进SC-CMs的发育和成熟。以下将从结构和功能两个层面探讨机械牵张的影响。

2.1 结构层面

大量研究表明，牵张刺激可从细胞排列、细胞形态和肌节发育等方面诱导SC-MCs的分化成熟。Ruan等[8]的实验表明，经过2周的静态牵张培养，组织中的细胞相比无刺激组均表现出更高的有序性，基质胶原纤维的排列也更加规则；Tulloch等[27]则深入地以对准值为指标，定量分析循环牵张对诱导多能干细胞衍生心肌细胞(iPSC-CMs)和胚胎干细胞衍生心肌细胞(ESC-CMs)组织中细胞排列的影响，与无张力组相比，持续的静态牵张培养和按一定频率施加张力的循环牵张培养都成倍增加细胞排列的有序性。有趣的是，机械牵张能引起人ESC-CMs和人心房成纤维细胞在垂直于牵张方向上重新排列[28-29]，而另有实验发现对于新生小鼠心肌细胞，其作用结果却是平行[30]。此外，在Abilez等[10]的长程培养中，施加牵张的人iPSC-CMs在培养至25～28 d时表现出异质的细胞表型，其中心室肌样细胞占比超过50%。对于肌节的发育，多数研究结果表明牵张刺激可促进工程组织中细胞的成熟，如更长的长度，更清晰整齐的横纹等[31-34]；Kroll等[9]设计了一种能对培养在聚二甲基硅氧烷薄膜上的单层人iPSC-CMs同时施加电学和机械刺激的设备，施加机械牵张的组别中肌节长度却明显缩短，推测这也许和其二维培养环境或施加牵张力前的其他环节有关。

微观表现上，机械牵张可有效促进SC-CMs心肌标志物的表达(包括RNA和蛋白质含量)。在众多实验[11，20，27，30，32，35-36]中，肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、α-肌动蛋白、N-钙黏蛋白、连接蛋白43、转录因子GATA4、转录因子Nkx2.5、心房钠尿肽和脑钠肽等重要心肌标志物均可被牵张刺激诱导表达，这些蛋白质对干细胞的形态、结构和功能发育具有重要作用；另外一个指标是β-肌球蛋白重链/α-肌球蛋白重链(β-MHC/α-MHC)的比值，其值的升高与心肌细胞的成熟相关[37]，在相应的研究中，α-MHC的含量不一定会下降，但β-MHC的表达量一般会被上调，且可高达800%[23，32]。

2.2 功能层面

在评价体外心肌细胞的功能时，收缩能力和收缩频率是主要指标，在许多实验中，细胞对心血管药物的反应性和钙流动力学表现也是重要的指标。研究表明，机械牵张能显著提升心肌样组织的主动收缩力[21]，其收缩力-前负荷关系也在合适的牵拉范围内符合Frank-Starling定律，且循环牵张相比静态牵张对曲线斜率的提升更加显著[23]，但机械牵张对细胞自主收缩频率的影响尚无定论[10，32]。对于一些药物如异丙肾上腺素和利多卡因，给予牵张培养的细胞能对其作出类似原生心肌细胞的反应，表现为收缩力相应的增强[38-39]。这些提升可能得益于胞内肌节的发育以及组织的整齐排列等[30]。在钙流动力学方面[9-10，23，32]，较为一致的观念是牵张刺激可明显提升钙瞬变峰值，这也印证了其提升细胞收缩力的作用。另外，通过进一步测量组织的收缩力-频率曲线(评价心肌兴奋收缩偶联的一个良好指标)，发现机械牵张有助于减弱细胞原本的负相关关系，向着正常心肌的正相关关系发展[8]。但在是否可缩短达峰时间、50%复极时间等问题上，目前仍有争议。

对于MI的治疗，培养心肌样细胞的目的是保证其在植入受损心脏后能起到足够的治疗作用，达到尽可能恢复患者心功能的目的。从这个角度说，实验室中评价SC-CMs是否心肌向分化成熟的最终方式应该是体内试验，而目前相关的研究并不多。在Mihic等[32]的MI小鼠模型实验中，虽然有无事先经受牵张刺激不会影响其心电图表现，但2D超声心动图显示牵张组的心室前壁厚度明显增厚，对处死小鼠进行尸检也可观察到该组的工程组织与小鼠心脏拥有更好的嵌合度。Abd等[15]发现向兔MI区域注入干细胞并养育8周后，与未经过牵拉刺激的干细胞组相比，受牵拉组的左室射血分数和左室短轴缩短率均明显改善，定量分析也显示受牵拉组的MI面积明显减小。这些实验一定程度上说明对干细胞进行移植前牵张刺激对于恢复受损心脏结构和功能的积极影响，但仍需更多的研究证明其真实性和重要性。

3 信号转导机制

如前所述，目前的研究大多停留在探究机械牵张的影响上，内在的信号转导机制尚不明确，有如下两条研究进展较大。(1)TRPV4/PI3K/Akt信号通路。TRPV4通道是允许Ca2+通过的非选择性阳离子通道，其活动导致胞内Ca2+升高，研究证明，单轴循环牵张能激活TRPV4通道引起Ca2+内流，并激活经典的调控多种细胞生命活动的PI3K/Akt信号通路，最终导致人ESC-CMs在垂直于牵张方向上的重排[29]。类似的，也有研究者发现对于毛细血管内皮细胞，机械牵张可通过TRPV4通道促进其重排，进一步验证了该通道的作用[40]。深入的实验表明，激活TRPV4通道引起的Ca2+内流只占牵张刺激引起的一部分，也就是说在牵张刺激和Ca2+内流之间，还有其他机制起着作用，如TRPV2通道[29]。(2)(miR-27a)/SCF通路。miR-27a参与调控细胞的多态性、肿瘤发生、增殖和凋亡等病理生理过程。Cao等[17]发现，当BMMSCs被施加循环牵张刺激时，miR-27a的表达有所降低，而过表达它则会下调GATA4、TNNT2、MEF-2C和连接蛋白43等心脏标志物的表达，这意味着miR-27a在机械牵张的条件下抑制了BMMSCs的心肌向分化；同时，作者通过一系列步骤证明SCF基因是miR-27a的作用靶点，转染SCF基因表达的siRNA可下调心肌标志物的表达，且同时转染这些siRNA和miR-27则会进一步增加下调的幅度。这些结果综合说明(miR-27a)/SCF通路在调控机械牵张对SC-CMs分化成熟的影响，但详细的内容仍需更多的研究加以阐述。

4 问题和展望

综上所述，机械牵张确实可在细胞形态、结构和功能等方面促进SC-CMs的成熟。但这方面研究存在的一个问题是研究的多样性，差异巨大的研究设计和设备使不同研究之间的可比性很差，相应的，在开发出能满足大多数学者要求的通用牵张施加设备和细胞培养环境上仍需更多研究和努力。此外，大多数研究的对照组仅设置在了是否施加机械牵张以探究其对SC-CMs成熟的影响，却缺乏这些细胞与原生心肌细胞的对比，因而无从得知这些衍生心肌细胞的实际分化成熟度，不利于其临床应用。事实上，即便机械牵张能有效促进SC-CMs的成熟，这种程度也远不及原生心肌细胞[27]，这也不难理解，成熟的心肌细胞是在复杂的生理环境下接受各种刺激并经过长时间的生长发育而来的，从理论上来说，单独模拟生理条件的牵张刺激自然很难在几天内让SC-CMs接近前者的分化程度。因此，内在的信号转导机制作为重要的启发和推进动力就显得格外重要，但目前也少被深入研究，且体内试验也屈指可数，更不用说进一步应用于临床。种种迹象均表明这方面的研究尚未成熟。结合目前的研究状况，未来研究需重点突破低促成熟效率和低分子机制认知程度，在充分认识内在信号转导机制的基础上，联合应用不同的策略，也许有助于尽早达到理想的效果。