中药在调控肝卵圆细胞恶性转化中的作用及机制研究进展

王楚皓，冯 斌，白 雪，陶 山，李 倩，陈 阳，史晓燕，段丽芳，范 妤

(1. 陕西中医药大学第一临床医学院，陕西 咸阳 712046；2. 陕西中医药大学基础医学院，陕西 咸阳 712046)

肝卵圆细胞(hepatic oval cell,HOC)是一种肝脏内的多能干细胞，正常状态下具有向肝细胞和胆管细胞分化的潜能[1-2]。有研究发现，HOC易受某些致癌因素影响异常增殖恶性转化成为致癌靶点，提示HOC在肝硬化转肝癌的过程中发挥重要作用[3]。探究调控HOC的恶性转化作用的机制成为当前研究肝癌防治机制的热点；在阻止或逆转HOC恶性转化中的作用中，多种中药及其活性成分发挥了有效作用。本文就在肝硬化转肝癌过程中HOC的恶性转化作用展开综述，同时总结目前中医药在抑制HOC恶性转化的研究现状，以期为HOC在肝癌发生机制的研究提供理论参考。

1 肝卵圆细胞

HOC呈卵圆形，体积小，核浆比例大，核卵圆形，胞浆嗜碱性且染色浅，是肝脏内的一种多能干细胞，在细胞因子的作用下具有向肝细胞和胆管细胞甚至向神经胶质细胞、胰腺内分泌细胞分化的潜能。目前认为HOC不仅分布于肝小叶内，还存在于Hering管及门静脉周围[4-5]。在正常成体肝脏中HOC处于静止状态，不易检测到，但当肝脏受损严重或肝脏细胞增殖能力降低时被激活，并增殖分化为肝实质细胞，发挥修复受损肝脏，重建肝脏结构及功能。活化的HOC可见多种特异性蛋白的表达：①胆管上皮细胞标志物，CK-7、CK-8、CK18、CK19、卵圆细胞标记物(OV)-6、GSTπ、连接蛋白(connexin)-43、A6；②幼稚肝细胞标志物，AFP、GGT、PKM2；③造血干细胞标志物，Thy-1、c-kit、CD34、干细胞抗原(Sca)-1；④神经上皮细胞标志物，嗜铬粒蛋白A、神经细胞黏附分子、甲状旁腺素相关蛋白[6]。

2 HOC与肝硬化、肝癌关系密切

2.1HOC的活化 HOC增殖分化的现象称为胆管反应，是一种对肝胆细胞损伤的修复反应。其激活与细胞微环境关系密切，1978年Raymond Schofield首次提出细胞微环境定义，通过特定的细胞外基质和龛细胞提供特殊的微环境，对维持干细胞的高增殖力和诱导定向分化起关键作用。目前HOC活化相关因素有：①来源于肝星状细胞的信号(Notch、TNF-α、TGF-β、HGF、EGF、IL-6等)；②来自于巨噬细胞的信号(Wnt、TWEAK、TGF-β)；③炎症因子(LIF、抑瘤素M、淋巴毒素-β)；④受损肝细胞直接作用(Hedgehog)；⑤来源于内皮细胞信号(SDF-1)；⑥层粘边蛋白[7-8]。当肝实质受损、微环境改变时，HOC被激活且大量增殖，首先出现在Hering管及门静脉周围，随后迁移至肝脏实质，在通往中央静脉的路径上不断成熟和向肝系或胆系分化，修复和重建肝脏。肝系分化过程包括成肝细胞(表达CK19肝样肝细胞，其体积大小介于HOC和肝细胞之间)、具有间质与肝胆表型的肝祖细胞(CK19、CK7表达阳性)、中间型肝细胞(CK19阴性、CK7阳性)、肝细胞；胆系分化包括反应性小胆管、胆管上皮细胞。HOC的增殖与炎症程度呈正相关，在中、重度肝实质炎症时，可见中间型肝细胞包围着HOC的现象[7，9-11]。

2.2活化的HOC参与肝硬化的形成 有研究表明肝假小叶的周围伴随着胆管反应，线粒体DNA基因分型显示胆管反应中的HOC与再生结节中的肝细胞有共同的起源，提示在肝硬化阶段，活化HOC参与了肝再生结节的形成[12]。肝硬化是多种因素所致慢性肝损伤致肝纤维化的最终结果，与肝星状细胞活化为成纤维细胞关系密切。肝星状细胞分泌的肝细胞生长因子(HGF)在体内外都可促进HOC的增殖；活化的间充质细胞产生TGF-β是最有效的肝促纤维化细胞因子， 其与avβ6整联蛋白的联合可调节HOC的功能[13]。成纤维细胞也可通过表达Jagged1，激活HOC的Notch受体，促进其分化[14]。此外，免疫反应与炎症因子也被证实参与此过程中，Ji等[15]研究证实白细胞介素-6(IL-6)是HOC增殖所必需，其发挥作用的途径有两种：一是通过促进HGF和TWEAK促炎性肿瘤坏死因子家族成员的表达，调节HOC和巨噬细胞相互作用，通过FN14受体对HOC具有促有丝分裂的作用；二是通过激活JAK/STAT3信号通路直接激活HOC增殖。可见，慢性肝损伤可激活HOC的增殖和分化，伴随着肝纤维化的发展与炎症因子的持续存在，HOC不断增殖分化，被动地参与了肝硬化的形成。

2.3肝硬化中HOC恶性转化参与肝癌的发生 肝硬化被认为是肝癌癌前病变，慢性肝损伤、炎症和纤维化是肝癌癌前微环境的特点。HOC作为肝干细胞在肝脏损伤时激活增生并参与组织修复，是肝脏在受损时的自我保护机制，但由于其具有高度分化的能力以及持久的增殖活性，在恶劣的肝组织微环境诱导下，极易导致HOC恶性转化，从而推进肝癌的进程[2]。研究显示CK19阳性肝癌患者高表达HOC其他细胞标记物(FRT7、CD133、GSTP1)，且CK19阳性肝癌患者比CK19阴性肝癌患者的瘤周胆管反应更为明显，血清AFP显著升高[16]。在乙肝致肝细胞癌患者中，同样观察到CK19阳性肝癌患者的癌前病灶主要由HOCs和中间型肝细胞组成，肿瘤大小、瘤周肝组织的炎症和纤维化程度与胆管反应分级显著相关[17]。付广文等[18]用免疫组化法计数不同肝病组肝组织中HOC内胆管上皮细胞标志物和肝细胞标志物的表达，结果显示CK-7、CK8/18、CK19在HOC中的表达情况为：对照组<肝血管瘤组<良性肝病合并肝硬化组<肝癌组<肝癌合并肝硬化组，表明HOC增殖数目与肝脏病变发展呈正相关；且HOC参与了原发性肝癌的生长、细胞分化调控。可见HOC参与肝硬化的形成，并受微环境改变的影响而趋于向癌细胞转化。

2.4多条信号通路在HOC恶性分化致癌的过程中发挥调控作用 目前公认的肝癌发生机制有两种：①成熟肝细胞去分化致癌变；②肝干细胞异常分化致癌变[19]。有文献报道HOC的上皮间质样转化、Wnt/β-catenin通路、Notch通路、TGF-β通路、miR216a/PTRN-Akt通路都参与了HOC的恶性转化过程。

2.4.1HOC的上皮间质样转化 上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮细胞向间充质细胞转化的过程，此时E-黏钙蛋白下调而N-黏钙蛋白上调，现研究已发现EMT是癌症进展中的重要过程。而HOC作为肝脏干细胞，其组织化学特征具有肝细胞Hepbar1、胆管细胞CK19、肝祖细胞OV-6 等标记物的表达[20]。在体外实验中发现，TGF-β1可促进HOC发生EMT，使其具有致纤维化作用[21]，Wang等[22]研究发现持续的EMT过程不仅使HOC参与肝纤维化，而且可能参与癌变。Dong等[20]通过裸鼠皮下移植HOC细胞，发现在经过EMT过程后，HOC细胞分化为间充质肿瘤组织，且在癌前期变化的阶段，HOC大多变为小肝细胞，小肝细胞是肝细胞的前身，少数小肝细胞在此环境下会继续不典型增生，使其具有癌细胞特点进一步发展最终形成肝细胞癌[23]。

2.4.2Wnt/β-catenin通路 经典的Wnt/β-catenin通路可促进HPCs分化为肝细胞，而非经典的Wnt信号通道在HOC中的激活足以诱导转化为HCC[17，24]。Imrich等[25]发现Wnt/β-catenin通路发生突变和异常激活后，过表达上皮细胞黏附分子(EpCAM)可促进HOC异常分化获得CSC特征，向HCC转变。有研究表明[26-27]，HOC中存在一个包含HNF4a和Wnt/β-catenin-snail轴的负反馈通路，阻止EMT和HOC向肝癌干细胞转化。HNF4α是维持细胞上皮表型的重要转录因子，可抑制上皮-间质转化过程，而snail基因是Wnt/β-catenin通路的下游转录因子，是EMT启动子。β-catenin可能存在于其胞膜、胞质、胞核，形成活性复合物。激活HOC时，β-catenin总量和活性显著增加，在细胞质中积累并进入胞核，作为转录因子激活下游靶基因。因此当Wnt/β-catenin通路异常时可促使HOCEMT相关标志物表达增加，获得LCSC特征。Ring1作为多梳妆蛋白的成员，在癌变和干细胞自我更新中发挥着重要作用。其过度表达激活Wnt/β-catenin通路，可使HOC出现增殖异常、核仁比例增大等低分化肝癌形成的表现，促使HOC向肝癌干细胞转化。此外，Ring1还可通过降解P53促进癌细胞的增殖和存活[28]。

2.4.3Notch通路 Notch信号通路在细胞增殖、分化、凋亡、再生等过程起着关键作用。Hes1是Notch信号通路的主要下游靶基因，常将其表达的水平作为评价Notch信号活性的指标。在Solt_Farber实验大鼠模型中，可观察到Notch1、Hes1在对照组不表达，而在模型组表达明显，提示肝细胞癌前病变伴有Notch通路的激活[29]。在CK19阳性HCC患者中，Notch信号通路(Notch1、Notch2、Notch3、JAG1、JAG2)上调明显，肝细胞特异性基因(HNF4α、ABCC2)表达减少，过表达上皮细胞黏附分子(EpCAM)，从而促进HOC异常分化获得CSC特征[16]。

2.4.4TGF-β通路 TGF-β通路是转化生长因子介导的一系列信号传递的过程，在细胞的生长、发育、分化中起着关键作用。TIC标志物的表达与肝硬化上调TGF-β水平密切相关，TGF-β水平的升高可促HOC通过miR216a/PTRN-Akt依赖通路获得TICs特征，改变HOC表型，促进HCC的发生发展[30-31]。此外，库普弗细胞被证实除促进HOC增殖外，对于HOC向LCSC转化也有影响。库普弗细胞是肝炎性细胞因子TNF-α的主要来源。TNF-α通过影响泛素D和CHK2触发HOCDNA损伤和染色体不稳定性，并通过TNFR1/Src/STAT3通路增强HOC的自我更新，促进HOC向LCSC转化[32]。

3 中药调控HOC恶性转化在防治肝癌中的作用及机制研究进展

中药是天然的化学分子库。研究证实，中药复方、单味药及其活性成分可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞周期阻滞和凋亡、抑制黏附侵袭能力、抑制肿瘤血管生成、调节机体免疫功能、增效减毒、逆转耐受等作用参与肝硬化及肝癌的防治[33-35]。针对HOC参与肝脏修复、易受微环境影响成为癌细胞潜在来源的特点，目前中药治疗以改善肝脏微环境、参与调控Notch、Wnt/β-catenin等信号通路诱导HOC向成熟分化，以达到防治肝癌的目的。

3.1调节信号通路诱导HOC成熟分化 苦参碱是由豆科植物苦参中提取的生物碱。其体外培养WB-F344HOC株，可通过下调Wnt-1表达诱导HOC向肝细胞方向分化[36]。Yang等[37]研究发现苦参碱干预后的大鼠HOC增殖模型中表达AFP细胞数量减少、强度减弱，并证实该药物可通过诱导下调Notch1 mRNA、Jagged1 mRNA的表达，以剂量依赖性的方式抑制HOCNotch通路，使具有高度分化潜能的HOC向成熟肝细胞方向分化。黄芩苷被证实可通过β-catenin通路逆转上皮间质转化，抑制癌细胞的产生和转移。此外，黄芩苷在治疗2-AFF/PH模型中，通过其抗氧化的作用抑制NF-κB信号通路，诱导增殖的HOC向成熟的肝细胞和胆管细胞分化[38]。扶正化瘀方通过下调Notch信号通路，诱导干细胞向成熟肝细胞分化，减少EMT抑制在肝细胞分化成熟过程中间充质细胞和胆管细胞的形成，可降低癌细胞的运动性、侵袭性和逃避免疫细胞的能力[39]。解毒凉血方临床上用于重型肝炎及肝衰竭的治疗，在Solt_Farber模型中，可见治疗组较模型组 CD34、Notch蛋白表达降低，ALB蛋白表达上调，提示其具有诱导HOC向成熟肝细胞分化的作用[40]。

3.2改善肝脏微环境 中药复方包含多种化学因子，其多靶点、多作用的整体治疗特点可通过提升人体免疫力、改善微环境达到治疗疾病的目的。微环境对于细胞分化方向尤为关键，肝脏组织结构不能完全的再生和修复可导致肝脏再生微环境的异常，与诱导HOC向HCC转化有着直接的关系。因此中药复方通过调控胞间信号通路来改变恶劣的微环境，以此促进诱导HOC正常分化是防治肝癌的重要手段。清肝化瘀方(苦参、白花蛇舌草、半枝莲、醋郁金、白术、醋莪术)通过调控ERK-MAPK、TGF-β1/Smads等信号通路作用，改善Solt_Farber模型肝脏微环境，减少炎症因子，使表达肝癌细胞表型的HOCAFP表达明显减少、ALB表达增多，诱导HOC向成熟肝细胞方向分化的同时恢复肝细胞的功能[41]。中医认为脾主运化，为后天之本。肝硬化及肝癌患者临床上有消化系统症状，加之久病致虚，故用四逆散加四君子汤疏肝理气，在调和肝脾的基础上更加注重健补脾胃，以此整体改善机体功能。四逆散加四君子汤可使HOC内HGFR、EGFR、CTGFR、TGF-β、FGFR表达增加，以HGF为中心的细胞因子体系改善肝脏微环境，通过整体对HOC的增殖、分化进行调节以防治肝癌的发生发展[42]。

3.3诱导恶性转化的HOC凋亡或自噬 苦参碱除可诱导HOC向成熟肝细胞分化外，还可通过抑制HOC的过度增殖，阻滞肝癌的发生发展。张伟硕等[43]建立Den+Solt-FarberSD大鼠模型后给予苦参碱干预治疗发现苦参碱干预可以促进HOC凋亡，同时减少或阻断HOC向肝癌细胞方向分化。谢步善[44]研究表明苦参碱通过下调HOCS6磷酸化水平，诱导HOC产生mTOR依赖性自噬，并证明p53失活通过调节AMPK激酶，参与到苦参碱诱导的自噬体的调控。

4 总结及展望

HOC具有向肝细胞或胆管细胞分化的能力，在正常成体肝组织中呈静息状态。当发生肝损伤时，HOC激活并参与肝脏再生修复及肝硬化形成的过程。由于微环境的改变，HOC的过度增殖和异常分化，使其成为肝细胞癌的潜在来源。现研究表明HOC在肝硬化及肝癌的发生发展中起着重要作用。因此如何抑制HOC的异常增殖和分化成为防治肝癌的重要部分。随着中药药理的发展，越来越多的中药被用于防治肿瘤疾病，通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞周期阻滞和凋亡、抑制黏附侵袭能力、抑制肿血管生成、调节机体免疫功能、增效减毒、逆转耐受等作用在抗肿瘤的治疗中取得显著成果，此外多靶点多作用的整体调节对慢性疾病具有很好的疗效。众多研究者针对HOC在肝癌发生发展中的作用和癌化的主要靶点，筛选中药有效成分进行深入研究，发现多种中药复方、单味药及其活性成分可通过调控HOC抑制肝癌的发生发展。目前，中药主要通过调节信号通路或改善肝脏微环境以此诱导HOC向成熟肝细胞分化,恢复肝脏功能，阻滞肝癌的发展。参与该过程的信号通路包括Notch、Wnt、Hedgehog 等信号通路。此外，还可诱导HOC凋亡或自噬，以阻止细胞癌变的发生。综上，HOC在肝癌发生发展中发挥着重要作用，同时中药对HOC防治肝癌进展有一定的作用，但对临床肝癌患者或肝硬化进展性肝癌患者的临床疗效仍需进一步的验证。就目前而言，中药应用于HOC防治肝癌的前景非常广阔。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。