调控动物生殖功能的lncRNAs研究进展

李海玲,方富贵

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

LncRNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，既往被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，不具有生物学功能[1]。然而，近年来的研究已经发现了大量的lncRNA参与调控动物的生长发育过程，其中包括细胞分化与凋亡过程、激素水平、器官发育、X染色体失活以及对基因组印记的调控[2]。但迄今为止，只有一小部分lncRNAs的功能与作用机制被阐明。如定量蛋白质组学分析揭示了lncRNA-Ftx通过上调MGC80-3细胞HK2促进胃癌的进展[3]；通过直接调控miR-27a/Smurf1轴，Xist的下调可在体内外减轻SCI模型的凋亡和炎症损伤[4]；lncRNA LEGLTBC作为竞争性内源性RNA发挥作用，调节miR-34a/ sirt1介导的糖毒性INS-1细胞的氧化应激和凋亡[5]。

目前已发现多种lncRNAs与动物生殖功能息息相关。如一些lncRNAs与胚胎干细胞、精原干细胞等增殖分化和自我更新过程关系密切，还参与胚胎发育、卵子发生等过程，并在抑制乳腺癌、卵巢癌等生殖肿瘤过程中发挥重要作用[6]。因此，深入研究生殖系统中lncRNAs功能和机制将丰富我们对生殖系统发育、功能及其疾病的认识，同时也为相关药物的研发提供新视角。本文主要综述了已发现的与动物生殖功能相关的lncRNAs及其作用机制，并对lncRNAs调控生殖的未来研究进行展望，有助于理解lncRNA在动物生殖调控中的功能与机制。

1 调控雄性动物生殖的lncRNAs

在人、大鼠和小鼠特定发育阶段的睾丸中已经鉴定出许多lncRNAs，其中一些lncRNAs的功能已经被注释和表征，例如睾丸特异性X连锁基因(Testis specific x-linked，Tsx)，减数重组热点基因(Meiotic recombination hot spot locus，Mrhl)和差异性甲基化区域(Differentially methylated region，Dmr)等，它们在睾丸发育和精子发生过程中发挥着重要的作用[2]。

1.1 Tsx

Tsx曾被认为是一个位于染色体失活中心的蛋白质编码基因，但随后被证明是一个lncRNAs，它的转录本在减数分裂中的生殖细胞、胚胎干细胞和脑组织中过表达[7]。小鼠和人类的X染色体失活需要存在一个cis作用位点，即X染色体失活中心(X-inactivation center，Xic)。这个位点控制X-染色体失活(X-chromosome inactivation，XCI)，并富含产生lncRNA的基因。在XCI过程中，上游位点Xite需要维持Tsx在未来活性X上的表达。Tsx位于Xite的正上游，其进化前体为脊椎动物的Fip112基因，由于其独特的位置和进化历史，因此颇受关注[8]。

人和小鼠Tsx基因具有显著的同源性，特别是在外显子1、3、4、5和6中[9]。研究发现，Tsx突变雄性小鼠的睾丸体积明显比野生型小，TUNEL分析显示随着动物第一次进行减数分裂，生殖细胞丢失，表明Tsx参与了雄性生殖细胞的发育；与此同时，Tsx在粗线期精母细胞中特异性表达，暗示其在生殖细胞减数分裂中具有一定的调控作用[7]。与在睾丸支持细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)中的表达量相比，Tsx在粗线期精母细胞中表达量最高；同时TUNEL染色和突触复合蛋白1(synaptonemal complex protein 1, SCP1)免疫荧光结合发现，小鼠Tsx基因敲除后，粗线期细胞的一个子集不适当地发生凋亡，敲除Tsx不影响减数分裂的XCI过程，提示Tsx在精子细胞中还有其他功能[10]。这些研究表明Tsx在精母细胞减数分裂进程中至关重要，但其具体作用机制还不清楚。

1.2 Mrhl

Mrhl全长2.4 kb，它是从位于8.26号染色体减数分裂重组热点位点(mrhl)的Phkb基因的第14个内含子转录而来的，是一个多聚腺苷和未剪接的RNA转录本，表达于肝脏、肾脏、脾脏和睾丸[11]。Kataruka等[12]研究小组绘制了Mrhl RNA 的染色质占用图，并表明Mrhl调节几种基因的表达，其中许多基因在精子发生以及Wnt信号传导中起关键作用，其中的基因之一是Sox8，MrhlRNA与Sox8启动子的结合伴随着其他调控因子的装配，包括Myc-Max-Mad转录因子、辅抑制因子Sin3a和辅激活因子Pcaf。在Wnt信号中，Sox8直接调控减数分裂前期和减数分裂标志物的表达。精原细胞中Wnt信号的延长激活导致了整体染色质结构的改变和干细胞标志物水平的降低。2008年，Ganesan等研究发现Mrhl通过两种分子机制调控精子发生。首先，在Drosha的作用下，Mrhl可被剪接成一个80 nt大小的中间体RNA，这些RNA位于GC1精原细胞系的细胞核内，可能与染色质相互作用[13]。其次，Mrhl通过与 Ddx5/p68蛋白相互作用实现负调控Wnt信号通路，这个信号通路在哺乳动物精子发生至关重要[14]。当Mrhl的表达下调时，酪氨酸磷酸化的p68蛋白从核内转运到胞质中，使β-连环蛋白(β-catenin)向核内移位并且活化关键转录因子TCF4，形成β-连环蛋白-TCF4复合物，其与目标基因启动子的Wnt反应元件(Wnt responsive elements，WRE)相结合，通过招募共激活因子(co-activators)或共抑制因子(co-repressors)调节相关基因表达。由于Wnt信号通路能够导致细胞分化，抑制细胞增殖，因此Mrhl在精原细胞的分裂和分化调控中发挥重要作用[15]。这些研究表明Mrhl对精原细胞的分裂和分化至关重要。仍需要对基因敲除小鼠进行进一步的研究，以确定Mrhl在精子发生中的调节作用。

1.3 Dmr

Dmr是一种过表达于睾丸的lncRNA，其基因位于小鼠5号染色体的G2位点和大鼠12号染色体的p11处。张等[16]研究发现，Dmr基因能够与来自小鼠19号染色体的Dmrt1(Dsx-and Mab3-related transcription factor-1)基因反式剪接，形成新的Dmrt1-Dmr嵌合转录物，该转录物编码一个羧基末端改变的蛋白质。在原代支持细胞培养物中过表达Dmr增加了这种改变形式的Dmrt1蛋白的丰度，降低了Dmrt1亚型的丰度，并导致Dmrt1靶基因的表达受损，模拟了Dmrt1功能表型的丧失[17]。很明显，反式剪接对Dmrt1有负调控作用；但不清楚的是，非典型亚型是否具有自身的调控活性。Dmrt1是一种保守的转录因子，可以通过上调精卵发生特异表达螺旋-环-螺旋转录因子1(spermatogenesis-and oogenesis-specific basic helix-loop-helix 1，Sohlh1)以维持支持因子的周期性表达来促进精原细胞发育，也可以通过抑制维甲酸(retinoic acid，RA)依赖性的视黄酸激活基因8(stimulated by retinoic acid gene 8，Stra8)因子的表达，从而间接抑制RA的转录以阻止精原细胞过早减数分裂[18]。Dmrt1在包括人类在内的多种脊椎动物和无脊椎动物物种中被认为与性别决定有关，并同时作为转录抑制因子和激活因子[17]。通过特异性敲除支持细胞中的Dmrt1基因，发现Dmrt1基因能够通过影响支持细胞的成熟而影响精子发生[19]。由此可见，Dmr可通过调节Dmrt1来影响精母细胞的发生与发育。雄性超甲基化(male hypermethylated，MHM)是与家禽Z染色体相关的基因座，在雄性生殖细胞中被甲基化并在转录上沉默，但在雌性生殖细胞中甲基化程度较低并转录成长链非编码RNA。在雄性动物中，MHM过表达会降低决定睾丸的基因Dmrt1的表达，导致胚胎死亡率增加[20]。但目前尚不清楚这些对比结果是由于特定分析系统的特殊性，还是反映了Dmr控制的调节范围。

1.4 其 他

越来越多的lncRNAs被发现与精子发生紧密相关，并参与雄性生殖细胞增殖、分化的调控过程，如在精子成熟过程中发挥调控作用的lncRNA HongrES2[6]，对精原干细胞多能性和分化产生影响的lncRNA AK052984、lncRNA AK011429、lncRNA AK005651、lncRNA AK028326，对精原细胞分化产生影响的Spga lncRNA1和Spga lncRNA2，对精母细胞减数分裂产生影响的lncRNA Kcnqlot1和Air[21]。虽然在精子发生的特定阶段有少数lncRNAs 的调控功能已得到确定，但还有很多与雄性生殖相关的lncRNAs及其具体的作用途径和机制有待阐明。

2 调控雌性动物生殖的lncRNAs

雌性生殖生物学的发生发展是一个复杂的、多基因参与的过程，涉及到生殖嵴的发育、卵子发生、卵子成熟、卵子激活、胚胎发育等一系列生殖生物学事件[22]。随着高通量测序及基因芯片技术的发展，研究发现越来越多的lncRNAs如Gtl2、核富含丰富的转录本1(Nuclear paraspeckle assembly transcript 1，Neat1)和母本印记表达转录本H19(imprinted maternally expressed transcript，H19)等在雌性生殖生物学发展进程中扮演着重要角色。

2.1 Gtl2

Gtl2是母本表达的长非编码RNA，位于鼠类12q染色体，其人源同系物Meg3基因在2000年被首次发现，定位于人类14号染色体14q32.2，长度约为1.6 kb(GenBank NR-002766)[23]。基因结构分析显示Meg3由10个外显子组成，并且可以通过可变剪切产生多种转录本[24]。在哺乳动物中，DNA甲基化(DNA methylation)是一种关键的表观遗传修饰形式[25]。在小鼠的研究中发现，母源Dlk1与Gtl2基因间差异甲基化区域 (intergenic differentially methylated region，IG-DMR)发生去甲基化，可促进lncRNA Gtl2的转录[26]。而lncRNA Gtl2可通过一些潜在的机制，如抑制DNA甲基化转移酶的作用或招募DNA去甲基化因子(如Tet蛋白)等，使得 IG-DMR 处于非甲基化的状态，导致Dlk1与Gtl2基因在不同亲本中差异性表达，从而参与基因组印记的调节[27]。Dlk1-Gtl2印记位点位于小鼠12号染色体远端，由多个母系表达的lncRNA和多个父系表达的蛋白编码基因组成，这个位点的印记在胚胎发育和产后生长中起着至关重要的作用[26]。且对于Gtl2表达模式的研究多集中于小鼠，在小鼠中，Gtl2在胚胎发育中具有时空特异性和组织特异性表达，亚细胞定位多见于细胞核，Gtl2在小鼠E3.5 d即出现表达并且为印记表达[28]。2010年，哈佛医学院研究组敲除Gt12第一外显子到第五外显子共5 kb区域进行了研究试验[26]。结果发现，母本Gtl2缺失导致小鼠围产期死亡和骨骼肌缺损，提示Gtl2在胚胎发育中起重要作用。同时母本Gtl2缺失也完全阻断了下游母系表达基因的表达，导致IG-DMR甲基化。相比之下，父系遗传缺失没有这种效果。这些数据有力地表明，Gtl2及其下游母本基因的激活在调节Dlk1-Gtl2印记中起着重要作用，可能是通过维持IG-DMR的活性状态。另有研究表明，Gtl2位点5'端的插入突变也会造成这一区间印记丢失[29]。研究中DNA甲基化是否在Gtl2表达调控中发挥主要影响作用及其调控的具体作用机制仍有待阐明。

2.2 Neat1

Neat1是一个长链非编码RNA，其在小鼠中的转录本长度约3.2 kb。目前的研究主要发现其参与旁斑结构的形成并且能与其他的蛋白质-RNA复合体共同参与修饰和加工处理编码蛋白质基因的转录本等生物学过程[30]。目前，在人的胚胎干细胞里的研究结果显示，Neat1主要通过RNA与蛋白质形成的复合体结构来发挥功能。研究发现在未分化的人源胚胎干细胞中，Neat1缺乏且无法形成旁斑,Lin28(该基因对于维持干细胞多能性具有重要作用)可以在转录之后快速出核，翻译产生干细胞维持所需要的Lin28蛋白质，而在分化过程中，Neat1通过形成旁斑这一亚核结构将Lin28mRNA滞留在亚核区，阻碍其出核翻译表达，表明Neat1具有调控人源胚胎干细胞的命运决定的重要作用[31]。Nakagawa等[32]发现排卵正常的Neat1敲除小鼠是随机性不孕，单侧移植野生型卵巢或黄体酮改变了表型，表明黄体功能障碍和低水平黄体酮是导致生育率下降的主要原因。尽管Neat1在大多数成人组织中表达微弱，但在黄体中高度表达。然而，近半数Neat1基因敲除小鼠的黄体组织严重受损[33]。Hupalowska等[34]研究发现在哺乳动物早期发育阶段，合子中母本和合子Neat1 RNA的缺失导致16至32细胞阶段的发育停滞，同时它的旁斑p54nrb的缺失也会导致16至32细胞周期的停滞，这与p54nrb基因敲除的胚胎致死率一致。Neat1受一种负性细胞周期调节剂p53的调控，研究从27名反复流产(recurrent miscarriage，RM)患者和配对的健康对照组中检测出6种候选lncRNA在绒毛组织中的表达，发现这些lncRNA的表达已被p53调节，而且RM患者组织样本中的Neat1水平显著降低[35]。这些结果提示Neat1对黄体形成和处于亚健康状态的妊娠至关重要。

2.3 H19

LncRNAH19是母源等位基因中表达的印记基因，过表达于人胚胎发育阶段，出生后表达下调，仅在骨骼肌和心肌中微量表达。H19是miRNA-675的前体，与胰岛素样生长因子2 (insulin-likegrowthfactor-2，IGF2)反义。H19 lncRNA通过miRNA-675反式调控骨骼肌的分化和再生[36]。最近一项研究分析了H19在人滋养层细胞中的过度表达，并用CCK-8技术检测了细胞增殖。然后，用基质试剂通过transwell法检测H19对人滋养层细胞的侵袭能力。逆转录聚合酶链反应显示，lncRNA-H19在早期自然流产患者绒毛组织和人工流产患者绒毛组织中过表达。此外，lncRNA-H19的上调抑制了HTR8/SV新滋养层细胞的增殖，lncRNA-H19的过表达表明HTR8/SVneo滋养层细胞的运动能力降低。LncRNA-H19抑制早期胎盘生长和早期营养层细胞，可能导致早期自然流产[37]。胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)的婴儿围产期发病和死亡的风险较高，H19基因在胎盘绒毛中大量表达，其在妊娠晚期调控组织病理学异常反应中起重要作用[38]。纤维组织可能导致一些子宫内膜异位相关症状的起源，如慢性盆腔疼痛和不孕。H19/miR-216a-5p/ACTA2通路的改变可能介导了子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells，ESC)的侵袭和迁移，研究发现子宫内膜异位症患者的H19和α平滑肌肌动蛋白(actin alpha 2，ACTA2)水平明显高于对照组，且子宫内膜异位症患者的H19和ACTA2水平呈正相关。荧光素酶检测表明，H19通过竞争抑制miR-216a-5p结合位点来调控ACTA2的表达[39]。这些研究表明H19在滋养层细胞的生殖及运动能力与胚胎发育中起调控作用，具体的分子机制仍需进一步研究。

2.4 其他

目前报道的其他与雌性生殖有关的lncRNAs还有：在妊娠后动物乳腺的发育及泌乳过程产生影响的lncRNA Pinc[40]，在卵巢发育过程起作用的lncRNA lncov1、lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274，对卵母细胞成熟和胚胎发育产生影响的lncRNA AK124742[41]，和在山羊初情期中特异性表达的lncRNA XLOC_777127、lncRNA XLOC_113511、lncRNA XLOC_446331[42]。目前这些lncRNAs的了解主要来自测序，有些仅证明与表型相关，对生殖活动方面的调控功能以及具体机制仍需进一步研究证实。

3 展 望

综上所述，目前已发现许多对调控精子发生、减数分裂、胚胎发育等生殖方面都有重要作用的lncRNAs。但有关调控生殖功能的lncRNAs研究才刚刚起步，仍有很多问题需要阐明：(1) 对lncRNA的研究主要集中于人和小鼠方面，与家畜繁殖相关的 lncRNA方面涉及较少；(2)生殖相关方面的 lncRNAs需进一步拓展；(3)一些具有调控生殖功能的lncRNAs具体作用途径和机制仍不清楚；(4)很多新发现与生殖有关的lncRNAs调控机制仍需进一步探讨。