促进脐血造血干/祖细胞植入策略的研究进展

2021-12-05宁柳心郝思国

上海交通大学学报（医学版） 2021年3期

宁柳心，郝思国

上海交通大学医学院附属新华医院血液科，上海200092

1988 年，一位患范科尼贫血（Fanconi anemia）的5 岁患儿首次应用人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）相合的同胞脐血移植获得成功，患者获得长期的无病生存［1］，由此拉开了脐血移植（cord blood transplantation，CBT）临床应用的序幕。此后非血缘的CBT 不仅在非恶性血液病患者中被应用，而且在恶性血液病患者中也取得了令人满意的效果。近数十年来，CBT在全球获得推广应用。

CBT 不仅来源丰富、采集方便，同时具有病毒污染概率小、供体无风险、可快速获得、能满足急需移植患者的需求等优点。另外，移植后移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）特别是慢性GVHD（chronic GVHD，cGVHD）的发生率低且程度轻。然而，虽然CBT 的GVHD 程度较轻，但其诱导的移植物抗白血病（graft-versus-leukemia，GVL）效应并不减弱。近年的研究［2］显示，急性白血病患者接受CBT 后复发率显著低于非血缘外周血干细胞移植（peripheral blood stem cell transplantation，PBSCT）。动物模型研究［3］显示，脐血中的T细胞较外周血T细胞具有更强的抗肿瘤效应。在动物模型中，外周血T 细胞所诱导抗肿瘤效应与异种反应性（xenoreactivity）相关，而脐血T 细胞的抗肿瘤效应则是由同种异体反应性（alloreactivity）所诱导。在脐血T细胞处理的动物模型中，肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocytes，TILs）主要为CD8+T 细胞，是抗肿瘤的主要效应细胞，CD8+TILs 分泌的细胞因子主要为肿瘤坏死因子-α 和穿孔素，CD4+TILs 主要为辅助性T细胞1；而外周血T 细胞处理的动物模型中，TILs 中CD8+T细胞的比例明显降低，CD8+TILs分泌的肿瘤坏死因子-α 和穿孔素显著减少，CD4+TILs 主要为辅助性T 细胞2。这些研究结果提示脐血T 细胞抗肿瘤效应显著强于外周血T 细胞。但是，由于单份脐血中造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC）数目较少，单份脐血所含的有核细胞（total nucleated cell，TNC）数仅为骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）或PBSCT 的1/20～1/10，导致行CBT 后造血系统和免疫系统重建较BMT或PBSCT明显延迟，发生植入失败、感染及移植相关并发症的风险较大［4］。因此，如何弥补脐血这些不足是提高CBT 治疗效果的关键，目前的策略主要有以下4个方面。

1 双份脐血移植

为了提高脐血的TNC 数量，20世纪90年代明尼苏达大学研究小组首先尝试了双份脐血移植（double CBT，DCBT）研究［5］，结果显示6 个月的移植相关死亡率（transplantation related mortality，TRM）为22%，1 年的无病生存（disease free survival，DFS）率为57%，证明了DCBT 的可行性和安全性。但所有DCBT 中只有1 份脐血植活，这份植入的脐血称为优势植入脐血。同时该研究结果提示，接受DCBT 的患者表现出快速造血恢复。此外，该研究组于2009 年首次发表了单份脐血移植（single CBT，SCBT）和DCBT 比较的单中心研究［6］结果：2组患者中性粒细胞和血小板植入时间相似，植入率也无明显差异；但是DCBT 组急性GVHD（acute GVHD，aGVHD）和cGVHD 的发生率显著高于SCBT 组，而5 年白血病复发率显著低于SCBT 组（P=0.04），尤其是急性淋巴细胞白血病患者；2 组患者无白血病生存期（leukemia free survival，LFS）和总体生存期（overall survival， OS）没有差异。欧洲脐血移植协作组（Eurocord）对SCBT 和DCBT 也进行了比较分析，结果显示2组移植后非复发死亡率及白血病复发率差异均无统计学意义，但是DCBT 组患者的aGVHD 和cGVHD 发生率显著高于SCBT 组，而DCBT 组的LFS 显著优于SCBT组［7］。因此，SCBT和DCBT究竟孰优孰劣，尚存争议。

此外，明尼苏达大学Wagner 教授领衔开展了首个国际多中心SCBT 和DCBT 的随机对照研究［8］。结果显示，DCBT 组和SCBT 组患者1 年总体生存率分别为65%和73%（P=0.17），而且2 组移植患者的DFS、中性粒细胞植入时间、TRM、移植后疾病复发率、免疫重建时间、Ⅱ～Ⅳ度aGVHD 以及感染发生率等差异均无统计学意义；不过有趣的是，SCBT 组血小板的植入更快，Ⅲ、Ⅳ度aGVHD 以及广泛型cGVHD 的发生率更低。为了验证这一发现，法国Michel 等［9］也进行了一项多中心的随机对照研究，研究包括数据完整的患者137 例，其中SCBT 组68 例、DCBT 组69 例。结果显示，DCBT 组在中性粒细胞和血小板植入时间、OS、DFS 方面显示出略微优势，但与SCBT 组相比差异均无统计学意义；2 组患者的移植后复发率无明显差异，但DCBT组的复发时间较SCBT组显著延迟（P=0.04），DCBT组的中位复发时间为282.4 d，而SCBT 组为164.9 d。同时亚组分析显示，在应用含氟达拉滨、环磷酰胺联合全身照射预处理的患者中，DCBT的复发率（7.1%）低于SCBT（21.9%，P=0.05）；2 组的GVHD 发生率无显著差异，不过DCBT 组广泛型cGVHD的发生率高于SCBT组。

2 脐血HSPC体外扩增

体外扩增是解决脐血HSPC数量不足的重要策略，多年来血液学家一直致力于脐血HSPC体外扩增的研究。但扩增的难题主要在于增加TNC 数量的同时，HSPC 也不可避免地发生了分化，导致扩增产物中较为原始的HSPC数量较少，从而影响扩增产物的植入。因此，如何在扩增HSPC 数量的同时避免HSPC 的过度分化是提高脐血HSPC 扩增质量的关键。目前，优化脐血HSPC 体外扩增的方式主要有以下5个方面。

2.1 含Notch配体的扩增体系

Notch 信号通路是重要的信号转导通路之一，Notch配体可通过结合HSPC 表面的Notch 1～4 调节其生长和增殖过程［10］。在纯化的CD34+细胞中加入重组的Notch 配体Delta 1，与干细胞因子、白介素-3、白介素-6、血小板生成素和Fms 样酪氨酸激酶3 配体（Fms-related tyrosine kinase 3 ligand， FLT-3L）共同培养16 d，CD34+细胞平均扩增倍数可达222 倍［11］。应用此扩增体系进行首次临床试验，对10 位患者进行DCBT，将其中一份脐血的CD34+细胞分离并进行体外扩增，另一份脐血未经处理；在未经处理的脐血输注4 h 后，输注扩增的CD34+细胞。结果显示，患者的中性粒细胞和血小板植入的中位时间分别为16 d和26 d，但3个月后外周血嵌合度分析结果表明维持造血功能的细胞大多来源于未经处理的脐血，提示扩增的脐血细胞可以促进脐血的早期植入，但扩增的细胞主要为较晚期的HSPC［11］。

2.2 含铜螯合剂的扩增体系

铜离子作为多种细胞酶的辅助因子，在细胞增殖和分化过程中发挥重要作用。高亲和力铜螯合剂四乙基五胺（TEPA）能够抑制细胞因子驱动的早期HSPC 分化，可在不影响HSPC分化能力的前提下增加其自我更新的能力。研究［12］证实，使用TEPA 处理脐血HSPC 后，可增强其长期扩增潜能。TEPA 通过降低细胞内铜离子浓度，延迟HSPC 分化，提高扩增产物中原始的HSPC 含量和增殖活性从而促进脐血植入［13］。一项大规模多中心的临床研究［14］采用经特殊处理的SCBT 治疗恶性血液病患者101 例，移植结果与同期接受DCBT 的295 例患者进行了比较。SCBT 中的部分脐血（20%～50%）使用含有TEPA、FLT-3L、白介素-6、血小板生成素和干细胞因子的培养体系扩增培养3 周后进行移植，结果显示中位TNC 数和CD34+细胞分别扩增至原先的400 倍和77 倍，CD34+细胞平均输注量达9.7×105/kg。中性粒细胞植入时间（21 d vs 28 d，P＜0.000 1）和血小板植入时间（54 d vs 105 d，P=0.008）与同期DCBT 组相比显著缩短，100 d的存活率显著提高（84.2%vs 74.6%，P=0.035），表明用TEPA 联合细胞因子进行扩增的脐血可显著缩短植入时间、改善患者预后。

2.3 含烟酰胺的扩增体系

烟酰胺（nicotinamide，NAM）是维生素B3 的衍生物、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）的前体和NAD 分解酶的有效抑制剂。临床前研究［15］已证实采用NAM 联合细胞因子培养脐血CD34+细胞可使其显著扩增，并可抑制其在体外过度分化。一项近期的临床试验研究［16-17］中，36 例患者采用清髓性预处理（myeloablative conditioning，MAC）方案后行DCBT，同时输注一份未经处理的脐血和另一份采用NAM 扩增21 d 的脐血。结果显示，与国际血液和骨髓移植研究中心统计的行CBT （80% 为DCBT，20% 为SCBT）且临床特征相近的患者（n=146）的移植结果相比，接受经NAM 扩增处理脐血的患者，中性粒细胞和血小板植入的中位时间分别为11.5 d 和34 d，分别缩短了9.5 d（P＜0.001）和12 d（P＜0.001）。该研究证实了NAM扩增体系用于离体扩增脐血的可行性、安全性和有效性。另一项研究［18］同样也表明应用NAM 扩增体系扩增的脐血移植后中性粒细胞植入更快，感染发生率更低，100 d内住院时间更短。

2.4 含StemRegenin-1的扩增体系

StemRegenin-1（SR1）是一种嘌呤衍生物，通过拮抗HSPC 中高表达的芳烃受体（aryl hydrocarbonreceptor，AHR）调控造血干细胞的自我更新和增殖［19］。明尼苏达大学的研究小组［20］报道，用含SR1 的扩增体系培养HSPC 可使CD34+细胞扩增50 倍，提高小鼠移植模型的植入率。Wagner 等［21］报道了一项使用SR1 扩增脐带血的临床研究结果，17 名患者在MAC 后接受了DCBT，在移植前15 d 从细胞数量较少的脐血中分离出CD34+细胞，用SR1 联合FLT-3L、血小板生成素和白介素-6 共同培养，而剩下的CD34-细胞则重新冷冻保存。移植当天，先将另一份未处理的细胞数量较多的脐血解冻并输入患者体内，4 h 后将扩增后的CD34+细胞和解冻的CD34-细胞一起输注。结果显示，扩增的脐血TNC 数量中位数扩增了854 倍，CD34+细胞扩增了330 倍。所有患者均成功植入，扩增的脐血在65%（11/17）的患者中成功植入，并且具有持久的植入（中位随访时间272 d），未处理的脐血在剩余6 名患者中成功植入。和历史对照相比，中性粒细胞（中位天数：15 d vs 24 d）和血小板（中位天数：49 d vs 89 d，P=0.001）的植入时间显著缩短，住院时间亦显著缩短，并且在aGVHD、TRM 和OS方面无显著差异。这一研究结果提示扩增的脐血同样可以长期植入。

2.5 含间充质干细胞的共培养扩增体系

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是造血微环境中重要的细胞成分，可通过直接接触或分泌细胞因子等方式调控造血细胞的增殖和分化。通过MSCs来模拟体内造血环境，可避免扩增培养中HSPC的过度分化［22］。最近的相关研究［23-24］发现脐带血HSPC 在低氧条件下与MSCs 共培养更能保持其干性。本研究组［25］早在21 世纪初就曾尝试应用MSCs 扩增体系来扩增脐血，含有MSCs 的扩增组在各时间点的TNC 数均显著高于对照组，TNC 中CD34+细胞、CD133+细胞、CD34+CD38-细胞以及CD34+CD133+细胞的比例也显著高于对照组；而且含有MSCs的扩增组各时间点各种祖细胞集落的种植率显著高于对照组，提示该扩增体系中较为原始的HSPC含量较高。de Lima 等［26］对31 例患者进行了相关临床研究，将一份扩增的脐血与另一份未扩增的脐血同时输注，7位患者MSCs来源于亲缘相关的半相合供体，其余患者接受第三方工业化生产的MSCs产品。双份脐血中细胞数量较少的一份在移植前2 周解冻，与MSCs 共培养，并加入干细胞因子、FLT-3L、血小板生成素和粒细胞集落刺激因子。结果显示，CD133+CD33+细胞和CD34+CD38-细胞显著增加；培养2 周后，TNC 和CD34+细胞分别扩增至12.2 倍和30.1 倍。与未扩增的脐血相比，扩增脐血输注的TNC和CD34+细胞中位数量增加了1倍以上。将未处理的脐血在移植当天解冻并输注，然后输注扩增的脐血。与历史对照相比，中性粒细胞和血小板的中位植入时间缩短了1 周或1 周以上，差异均有统计学意义；而aGVHD和cGVHD的发生率无显著差异。但移植后6个月时检测提示仅有13%的患者体内存在扩增的脐血，而超过1 年的检测提示患者体内造血细胞均来自未扩增的脐血，提示含MSCs 的扩增体系中HSPC 仍难以维持长期造血，只能维持短期造血重建［27］。

3 促进脐血HSPC的归巢

CBT 除了通过DCBT 以及离体扩增来解决单份脐血HSPC 数量不足的问题外，促进脐血HSPC 归巢也可改善脐血植入［28］。目前该方面的研究主要集中在以下2 个方向。

3.1 骨髓腔内直接注射脐血

目前，CBT 通常通过静脉输注的方式，但在静脉输注的过程中，脐血HSPC易被宿主通过多种机制扣留，导致归巢至骨髓的有效细胞数量减少，将脐血直接注射到骨髓腔可以加快HSPC的归巢［29］。Murata等［30］开展了一项骨髓腔内直接注射单份脐血的Ⅱ期临床研究，共纳入21 例恶性血液病患者，没有观察到与骨内注射有关的严重不良事件，结果显示中性粒细胞和血小板植入的中位时间分别为17 d 和32 d，Ⅱ～Ⅳ级和Ⅲ～Ⅳ级aGVHD 的发生率分别为44%和19%，证明了骨髓腔内直接输注脐血的安全性。此外，Okada 等［31］也开展了相关临床研究，共纳入40 例血液系统恶性肿瘤患者，在局部麻醉后分别将脐血注射到髂骨的4 个部位（每侧2 个部位），每个部位大约注射6 mL脐血，结果显示86.8%的患者获得植入，中性粒细胞和血小板植入的累积发生率分别为86.4%和85.5%，植入的中位时间分别为17.5 d 和44 d，重度aGVHD 的发生率为47.5%，广泛型cGVHD 的累积发生率为3%，这些结果表明骨髓腔内直接注射脐血可改善造血系统重建并降低cGVHD 的发生率。最近，一项前瞻性临床研究［32］统计了23 例接受单份脐血骨髓腔内注射的患者，结果显示注射后28 d 中性粒细胞植入的累积发生率为（77.3±9.0）%，90 d 中性粒细胞＞0.5×109/L 和血小板＞50×109/L 的累积发生率分别为（82±9）%和（70±10）%，所有患者均未出现严重的aGVHD。该研究进一步证明了骨髓腔内注射脐血移植是可行的，可以促进血液系统造血功能的恢复；同时证明了将脐血干细胞直接输注到缺氧的造血干细胞壁龛中有助于保留其干性。

3.2 前列腺素E2的应用

前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）具有刺激多系祖细胞增殖和归巢的潜能。由于PGE2的半衰期短（1～2 min），在体外研究和临床研究中常使用PGE2 的稳定修饰物16，16-二甲基前列腺素E2（16，16-dimethyl-PGE2，dmPGE2）。dmPGE2可在体内增加HSPC 数量而不影响其自我更新和分化潜能［33］。

这是通过调控HSPC 增殖和分化相关的Wnt/β-catenin信号通路实现的［34］。Cutler等［35］对12名接受DCBT的患者进行了Ⅰ期临床试验，旨在评估使用dmPGE2 离体处理单份脐血的安全性和治疗效果。将细胞数量较多的一份脐血与10 μmol/L dmPGE2 在37 ℃下一起培养2 h 后输注给患者，另一份未经处理的脐血在4 h 后输注。结果显示中性粒细胞植入的中位时间为17.5 d，短于历史对照的21 d（P=0.045）。此外，12 名患者中的10 名患者获得处理脐血的长期植入，推测dmPGE2促进HSPC 归巢的作用可能加速其植入，尽管可能也与dmPGE2 处理的脐带血细胞数量较多有关。

4 第三方HSPC的应用

应用第三方HSPC 与脐血联合移植（haplo-cord transplant）可能会加快脐血的植入。van Besien 等［36］在一项回顾性研究中比较了97 例接受单倍体干细胞联合SCBT 和193 例接受DCBT 的恶性血液病患者，结果显示前一组患者中性粒细胞和血小板植入更快，Ⅱ～Ⅳ级aGVHD 和cGVHD 发生率更低，复发率和无GVHD、无复发生存（GVHD-free relapse-free survival，GRFS）率也更低，差异均具有统计学意义。同时，单倍体干细胞联合CBT 对缺少HLA 匹配供者的患者而言也是一种较容易获得的移植物来源。此外，有研究［37］报道了42 例单倍体干细胞联合CBT 治疗高危恶性血液病的患者，结果显示中性粒细胞植入的中位时间为11 d，血小板植入的中位时间为19.5 d，1 年非复发死亡率为19%，3 年GRFS 率、无进展生存率和总体生存率分别为53%、62%和65%，中位随访42 个月，与van Besien 等［36］的研究结果一致，表明接受单倍体干细胞联合CBT 的患者在造血系统重建和GVHD的发生率方面均优于DCBT组。