基因编辑治疗视网膜疾病的研究进展

周紫依 游志鹏

视网膜疾病可以是遗传来源或多危险因素共同作用的结果。遗传性视网膜营养不良(IRD)是一种罕见的遗传性视网膜疾病，可由280多种基因突变引起，除线粒体遗传外，还以常染色体显性、隐性或X连锁方式遗传，均可导致功能性视力丧失，并常常发展为失明[1]。迄今为止，临床上最先进的IRD基因治疗方法是采用基因扩增策略，将突变基因的野生型(WT)cDNA包装在腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒(LV)载体中，并将该载体转运入视网膜中。目前至少有10种不同的基因增强疗法正处于临床试验中，并且发展迅速[2]。

然而，提供突变基因正常拷贝的基因增强疗法仅适用于治疗单倍体功能不足或功能缺失的突变，并不能直接影响致病基因。成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关核酸酶(Cas)系统(CRISPR/Cas)是最有效且通用的基因编辑工具，能简单地将Cas核酸酶与控制基因组位点识别的RNA结合起来，有直接纠正患者DNA中的突变或抑制显性突变表达的可能。Cas9/gRNA复合物通过在特定位点切割DNA，触发2种修复机制：同源介导修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)。在外源性供体DNA存在的情况下，基因组中的突变可以通过HDR来替代/纠正。而NHEJ作为一种普遍的修复过程，通过在目标位点引入错误序列导致致病基因失活。基因编辑的发展异常迅速，CRISPR/Cas系统加速了基因编辑的革命。

1 CRISPR/Cas系统的来源与发展

20世纪90年代，研究人员在细菌与古菌内发现了CRISPR/Cas系统，其为一种依赖于小RNA的适应性防御系统，可特异性检测和沉默入侵质粒和病毒的核酸。2012年，Doudna和Charpentier团队发现，通过融合crRNA和tracrRNA，可以构建出一种特异性的单链向导RNA(gRNA)，其可与SpCas9偶联，从而诱导靶DNA双链断裂(DSB)[3]。有趣的是，Kleintiver等[4]还设计了SpCas9的变异株，命名为VQR和VRQR，该变异株具有新的原间隔序列邻近基序(PAM)特异性，实现了基因组编辑在大范围位点上的应用。最近，SpCas9的变体xCas9被发现，与WT-SpCas9相比，具有更强大的PAM兼容性和更低的脱靶活性[5]。

如前所述，DSB可激活修复机制NHEJ或HDR。除目标位点上的单个DSB外， NHEJ还可修复2个连续的DSB，使DSB之间的DNA序列被高效且精确的删除[6]，或者利用多个DSB同时敲除若干基因组位点，都是可行的。值得注意的是，同时存在一个以上的DSB可能导致基因组重排，包括gRNA靶位点区域的倒转或重复，以及染色体易位[6-7]。另外，通过将CRISPR组分与靶位点同源的双链或单链供体DNA一起引入细胞，HDR机制可精确纠正特定的点突变或在内源性调控元件的控制下引入基因的WT序列。CRISPR/Cas系统的主要局限在于可能导致部分同源DNA位点发生意外突变(称为脱靶)，从而限制了该技术在临床治疗中的应用。目前通过使用在视网膜细胞中特别活跃的启动子来限制Cas核酸酶的表达，从而减少脱靶现象的发生。除此之外，还有其他数种方法可将脱靶概率降到最低。首先被提出的方法依赖核酸内切酶(Cas9n D10A)[4]以及两股互补于目标位点相反链的gRNA，此二者识别并切割特异性DNA位点，产生DNA双链缺口，使特定位点的DSB被NHEJ高效修复，并使脱靶效应最小化[8]。其次通过特定残基的诱变产生4种SpCas9变体，分别是SpCas9-HF1、eSpCas9、HypaCas9和evoCas9，这些变体相比于WT SpCas9，在保持靶点编辑效率的同时，降低了脱靶可能[9]。最近，Vakulskas等[10]在SpCas9中引入单点突变(R691A)，当其编码的蛋白质与gRNA结合形成核糖核蛋白(RNP)复合物时，可以保持精确的靶向裂解以及减少靶外编辑，确保了Cas9/gRNA复合物能够介导高水平的基因编辑任务。再者，加快蛋白质的降解可使脱靶效应降低[11]。

除基因编辑外，CRISPR/Cas9系统还可以用于转录水平的细胞编程，无需对基因组进行永久性的修改。为此，可以将催化失活的“死亡”Cas9(dCas9)与转录调节因子融合，从而调节靶基因的表达，使其能够识别靶位点而不发生任何裂解作用[8,12]。

另一种CRISPR介导的基因编辑方法允许1个碱基直接且不可逆地替换另一个碱基，而不需要诱导DSB或利用HDR的过程。为了在基因组DNA中实现4种转换突变(C到T、A到G、T到C和G到A)的可编程安装，有研究开发了一种融合蛋白，包括dCas9或nicks D10A、大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1或腺嘌呤脱氨酶，以及细胞碱基切除修复机制的抑制剂，如尿嘧啶糖基化酶抑制剂。所得到的碱基编辑器在多个细胞系中显示出较高的碱基编辑效率和较低的插入/缺失错误[13-14]。进一步改变PAM的碱基编辑器，提高了产品纯度和特异性[15]。“搜索和替换”是基因编辑方法的最新突破，用于介导所有可能的碱基之间的相互转换、靶向插入和删除[16]。该系统依赖于Cas9-nickase(H840A)、M-MLV-RT和先导编辑扩展的指导RNA(pegRNA)，为反转录提供遗传信息。

2 CRISPR/Cas体内外的传递系统

CRISPR/Cas系统病毒和非病毒载体传递系统将CRISPR/Cas组分在体内或培养细胞中传递。目前为止，AAV已成为视网膜靶向基因编辑最常用的传输载体，但也有其他的病毒载体存在，如LVs和腺病毒载体(Ads)。AAV是一种具有广泛传染性的非致病性DNA病毒，但由于AAV相对较小的装载容量使得SpCas9和gRNA的同时运送难以达成，因而促使双载体AAV系统的开发，使其能分别携带SpCas9和gRNA，并在需要时携带外源性的健康cDNA。此外，为了避免装载容量有限的问题，许多研究小组使用了来自金黄色葡萄球菌(SaCas9)、空肠弯曲菌(CjCas9)、嗜热链球菌(StCas9)、脑膜炎奈瑟菌(NmCas9)和属于V型CRISPR系统的AsCpf1、LbCpf1核酸酶的Cas序列，其特点是编辑效率与SpCas9相当，且能识别出NGG以外的PAM，从而扩展了目标序列的组合[9]。除病毒传递外，非病毒传递同样也是CRISPR/Cas系统的有效传输手段。第1种也是最简单的方法是依赖质粒对靶组织的电穿孔[17]。然而，这种技术对组织有很强的损伤，这使得质粒电穿孔不适合用于患者的治疗干预。第2种则是利用RNPs作为Cas9/gRNA复合物的传递方法，由于其能实现高效的基因编辑和有效减少脱靶效应，目前备受瞩目[18]。除上述外，将阳离子脂质包装的Cas9-RNP进行体内注射的方法也被报道[19]。

3 基因编辑在视网膜疾病中的应用

基因编辑技术有可能直接纠正患者DNA中的突变，或消除显性突变的表达，达到从源头上治疗疾病的目的，为遗传性疾病的治疗提供了更多的可能性和新的途径。

3.1 基因编辑在隐性基因突变引起的视网膜色素变性中的应用引起IRD的基因突变中约有1/3会导致非综合征性视网膜色素变性(RP)[20]，由于RP中大多数突变基因编码的蛋白质在光感受器或视网膜色素上皮(RPE)细胞中表达，因此RP的特征是视杆细胞变性，继而视锥细胞丢失，最终导致患者的视觉缺损甚至失明。迄今为止，RP的治疗方案旨在通过基因治疗来纠正基因缺陷，或将视网膜前体细胞或诱导多能干细胞(iPS)移入玻璃体或视网膜下腔，同时利用膳食补充剂或细胞替代疗法发挥独立于遗传缺陷的治疗效果。尽管基因增强治疗仍在进行，但已有人用CRISPR/Cas9触发的HDR来研究由不同基因(RPGR、MERTK、PDE6b、MAK、CEP290等)隐性突变引起的多种RP[21-24]。如前所述，CRISPR/Cas9诱导的DSB可利用细胞HDR机制进行精确的基因修饰，这一过程依赖于同源双链DNA作为修复DNA合成的模板。在外源DNA模板存在的情况下，HDR途径的精确修饰作用可以潜在地纠正导致RP的所有基因缺陷。然而，自然发生的HDR修复依赖于细胞有丝分裂，对于出生后失去分裂能力的多种体细胞(例如感光细胞)来说，HDR发生效率极低，难以实现在体基因修复。因此，对患者来源的iPS细胞进行基因矫正，然后通过自体移植分化从而矫正视网膜细胞功能是一种有效的治疗方案。Bassuk等[25]报道了一种新的CRISPR/Cas9方法，其可用来修复iPS细胞中RP调节基因ORF15外显子的一种无意义突变，该突变可导致X性染色体连锁遗传性RP。HDR通过转染含有SpCas9/gRNA成分的患者来源的IPS细胞和携带正确氨基酸序列的单链供体寡核苷酸(ssODN)模板，使13%无义突变得到纠正。这项研究将CRISPR/Cas9介导的基因编辑与自体IPS细胞移植相结合，是开发针对IRD的个性化移植策略的第一步。

Jin小组还对RPGR基因的突变进行了纠正[26]。他们从3例RPGR基因发生移码突变(外显子14或ORF15的突变)的患者中获得iPS细胞，并诱导其分化为RPE细胞和3D视网膜，该策略的实施需要SpCas9/gRNA质粒电穿孔患者来源的iPS细胞、携带正确第14位外显子序列的供体模板质粒和一个可切除的新霉素耐药盒。在所选的12个新霉素的克隆中，有2个基因被纠正，并且在3D视网膜器官中分化后，显示RPGR转录完全恢复，该视网膜中睫状体病变缺陷得以修复。

CRISPR介导的HDR策略可用来纠正Pde6β基因外显子7中的Y347X突变，该基因在rodless-rd1小鼠中突变，是一种以光感受器退化和视力丧失为特征的RP模型[27]。将Cas9/gRNA和ssODN供体模板分别注入FVB/N自交系合子的原核和细胞质中，产生11个供试者，检测其基因缺陷的纠正情况。作者报道了与Bassuk等[25]研究相同的HDR效率，11位供试者中有2位(F0)将ssODN供体分别合并到36%和19%的体细胞中。尽管视网膜电图(ERG)和光学相干断层扫描(OCT)的分析结果显示，这些小鼠视杆细胞的功能恢复是根据纠正细胞的百分比来决定的，但本研究CRISPR介导的HDR在体内的可行性提供了明确的证据，证实了该策略潜在的临床应用价值。2017年，在患者来源的iPS细胞中发现了一种由于用HDR的方法来纠正3种RP而引起的突变：雄性生殖细胞相关激酶(MAK)基因的外显子突变、CEP290基因的深内含子隐剪接位点突变和RHO基因的显性功能增益突变[28]。为了解决MAK基因第9位外显子中Alu的纯合子插入问题，将携带SpCas9和gRNA表达盒的质粒与携带正确第9位外显子序列的HDR供体质粒以及可切除的嘌呤霉素耐药盒共同转染。经过嘌呤霉素的筛选，1/6的耐药菌落表现出单等位基因的纠正，从而使包含外显子9的转录和全长MAK蛋白翻译得以恢复[28]。

最近，一种类似于HDR介导的方法被用来纠正Mer酪氨酸激酶受体(MERTK)基因第7外显子Ser331Cysfs*5突变引起的常染色体隐性RP(arRP)[29]。患者来源的iPS细胞被RNP复合物核感染，RNP复合物由增强的特异性eSpCas9蛋白[30]和化学合成的crRNA和tracrRNA组成。与以往的研究不同的是，患者来源的iPS细胞由RNP复合物成核，该复合物由eSpCas9蛋白20和化学合成的crRNA和tracrRNAs组成，具有强特异性。与RNP一起提供了携带外显子7部分正确序列的ssODN。利用高通量测序筛选个体克隆，以识别纯合子或杂合子的校正。2个克隆均表现出多能性和正常核型。

最近有一项关于HDR介导的体内arRP突变校正的开创性研究。Cai等[31]开发了一种基于HDR的Cas9/RecA系统，用于精确纠正出生后无瘤rd1小鼠的Pde6b错义突变。这个新的系统结合了大肠杆菌重组酶A(RecA)蛋白[32]和SpCas9/gRNA。基本上，RecA蛋白被MS2标记，将RecA-MS2复合物与2个连接到以Pde6b位点外显子7为靶点的gRNA的MS2 RNA结合序列连接。将ssODN供体模板与SpCas9和RecA-MS2-gRNA共同表达在新生rd1小鼠中，将错义突变还原为Tyr的WT序列编码。电穿孔小鼠光感受器标记物的免疫荧光分析显示，Cas9/ reca介导的校正促进了视杆细胞和视锥细胞光感受器的存活。此外，ERG分析显示，与对照组相比，用Cas9/RecA系统处理的rd1小鼠的视觉功能增强。

3.2 基因编辑在隐性基因突变引起的Leber先天性黑矇中的应用Leber先天性黑矇(LCA)可由17个基因突变引起，通常与常染色体隐性遗传有关。超过一半的LCA是由于GUCY2D、CEP290和RPE65基因突变引起，这些突变会对视杆细胞、视锥细胞或RPE细胞的存活产生负面影响，并从患者出生起就开始导致视力下降。

基因增强治疗是某一特定基因的常染色体隐性突变引起的IRD可行的候选方案。而由CEP290基因IVS26隐性突变引起的LCA 10型(LCA10)目前通过反义ODN[33]或CRISPR介导的治疗得到解决[28,34-35]。内含子突变产生一个新的剪接供体位点，该位点在异常剪接时，导致一半的转录产物中都包含一个短的外显子密码，从而产生一个提前终止密码子。因此，删除包含IVS26突变的内含子区域，可以恢复CEP290的表达。最近开发了一种针对内含子26、结合SaCas9并包装成AAV5载体的双gRNA，并标记为EDI 101产物[35]。该研究报道了一种有效和安全的基因编辑方法，可以对经视网膜下注射EDI101的猴子进行基因编辑。此外，他们还证明了视网膜下腔给药在所有动物中都具有良好的耐受性，而在非免疫抑制的猴子中只有轻微的炎症可能与AAV5有关，这为第1种治疗LCA10的CRISPR药物铺平了道路。

3.3 基因编辑在显性基因突变引起的视网膜疾病中的应用依赖NHEJ途径的基因破坏是发展中的RDs尤其是那些由显性突变引起的RD最常用的治疗方法。在功能不佳的应激细胞中，显性等位基因的缺失可能导致该等位基因编码蛋白质的逐渐减少，而WT基因的持续表达则可以增强这些剩余细胞的功能。在这方面，有效区分突变体和宽型等位基因，确保突变体的特异性中断是成功的关键。Bakondi等[36]研究表明，在携带S334ter鼠类视紫红质等位基因的转基因大鼠模型中，spcas9/gRNA组分的电穿孔导致突变等位基因的破坏，从而防止视网膜退化和改善视功能。然而该策略不能区分WT和突变等位基因，因此不能用于未来的临床应用。有研究者介绍了更为实用和符合生理特性的方法来抑制视紫红质基因的显性突变[37-38]。两组都设计了一个P23H特异的gRNA来敲除P23H基因敲入小鼠中的突变小鼠的等位基因，并将工程化的SpCas9 VQR变体与特异性的gRNA结合，主要插入突变等位的基因上[37]。Li等[38]将5’端截短的17-核苷酸gRNA与SpCas9 VRQR 结合，通过视网膜下注射质粒和电穿孔，使突变体和WT等位基因的鉴别更为高效。然而，这种方法的临床应用可能很困难，因为需要侵入性手术将微电极放置在目标细胞附近以限制组织损伤。相反，Giannelli等[37]将Cas9和gRNA包装在2个带有人工合成衣壳变体(AAV9-php)的AAV9载体中。通过玻璃体内注射可以更有效地高水平(70%)转导视杆细胞光感受器。提示使用传输系统部分恢复视网膜功能具有广大前景。

视紫红质基因突变占常染色体显性遗传RP的30%和IRD的15%，为了将基因编辑方法扩大到视紫红质基因的150多个突变的绝大多数中，提出了一种不依赖于突变的敲除策略。2016年，Latella等[17]在电穿孔的P23H转基因小鼠体内发现了一种SpCas9表达质粒，该质粒携带2个gRNA，位于人视紫红质基因P23H突变的两侧。该研究证实了CRISPR介导的人突变型视紫红质基因的体内敲除效力，为Tsang团队最近采用的联合基因消融和替换策略奠定了基础[39]。Tsai等[39]报道了一项对携带P23H或D190N突变的2个敲入小鼠进行的概念验证研究，表明切除和替换策略可以改善疾病进展，这在2种突变均存在的敲入小鼠模型的光感受器结构和功能检测中得到验证。这一策略原则上可用于治疗与RP相关的RHO基因的所有突变，从而避免疾病的等位异质性。类似的方法也被用于治疗小鼠和灵长类动物的常染色体显性锥杆营养不良症(CORD6)[40]。该病是由编码视网膜鸟苷酸环化酶-1(retGC1)的GUCY2D基因的显性突变引起，该蛋白在光感受器受体中表达，参与光转导后恢复暗状态所需的cGMP的重新合成。Mccullough等[40]提出用非突变cas9/gRNA方法阻断野生型和突变型内源性GUCY2D等位基因的表达，并对抗基因编辑的野生型GUCY2D cDNA进行补充，获得了抗基因编辑的AAV载体。在这项研究中，作者只报道了治疗策略的第一部分，即在视网膜下腔注射2个AAV，一个表达SpCas9，另一个携带与GUCY2D基因第4外显子相结合的gRNA，消融猕猴光感受器内源性等位基因GUCY2D。他们证明了在经过治疗的眼睛中retGC1的表达大幅降低，这证明了在灵长类动物中使用AAV-CRISPR/Cas9进行体细胞基因编辑的能力。

3.4 基因编辑在在非特定致病基因引起的视网膜色素变性中的应用一种不针对特定致病基因的视网膜变性基因治疗方法已被提出。棒状神经视网膜亮氨酸拉链(Nrl)基因[41]或其下游转录因子Nr2e3[42]的基因敲除研究在成年小鼠视杆细胞中成功地进行了杆状-锥状重编程。视锥细胞对视杆细胞感光细胞上RP特异性基因的突变具有抗性，从而防止了继发性视锥细胞的丢失。Yu等[41]利用表达Nrl基因第3外显子的SpCas9和gRNA的2个AAV，对3个视网膜退行性变小鼠模型(Rho-/-、Rd10和Rho-p347s)进行了视网膜下腔注射。他们发现接受Nrl消融治疗的视杆细胞对突变型视紫红质蛋白或PDE6β缺陷的有害影响更具抵抗力，从而有助于延长视锥细胞的存活时间。CRISPR介导的Nrl转录调控最近也被Mali团队提出作为一种治疗RP的方法[43]。作者利用由dCas9融合到KRAB结构域的AAV-split-Cas9载体平台诱导Nrl的转录抑制而无需对基因组进行永久性的修饰。他们报道了rd10小鼠治疗后眼睛的外层核层(ONL)变厚，证明其阻止了光感受器的退化并保留了ONL，同时通过视觉运动性眼球震颤检查，证明改善了视觉变性功能。

3.5 基因编辑在年龄相关性黄斑变性中的应用CRISPR基因编辑技术也可用于治疗非遗传性的多因素RD，如年龄相关性黄斑变性(AMD)。正如抗血管内皮生长因子(VEGF)药物所证明的那样，永久性抑制RPE细胞中的VEGF可能有一定的益处。这可以通过CRISPR介导敲除促血管生成因子VEGF来阻止新血管生成来实现。Kim等[44]报道了于项关于CRISPR/Cas系统治疗AMD的研究。他们开发了携带CjCas9的AAV9载体和根据Vegfa基因定制的gRNA,Vegfa基因在视网膜中的表达与脉络膜新生血管形成(CNV)有关。载体经玻璃体内注射到RPE细胞。注射后6周，他们通过激光治疗在眼内诱发CNV，1周后，他们观察到由于RPE 细胞中Vegfa表达的部分抑制，CNV区域明显缩小。Kim团队利用SpCas9和包装成RNP的vegfa特异性gRNA，增强了CRISPR/ Cas9系统对于AMD的效力[19]。在之前的研究中，他们观察到在视网膜下腔注射Vegfa-RNP的小鼠与对照组相比，CNV区域明显减少。虽然RPE细胞的编辑作用仅限于注射部位，激光诱导的小鼠CNV模型不适合多次注射Cas9 RNP，但作者证明眼内 AAV-CjCas9系统在注射14个月后仍具有持久、有效和安全的作用[45]。此外，Kim的研究小组利用LbCpf1核酸内切酶下调小鼠视网膜Vegfa的表达[46]，LbCpf1核酸酶作为CjCas9，体积相对较小(3.7 kb)，与携带Vegfa特异性crRNA的AAV9载体的包装容量相兼容。单个载体通过玻璃体内注射进入小鼠视网膜。作者观察到Vegfa的破坏导致激光诱导的CNV面积的长期减少，而没有引起视锥细胞的功能障碍。Huang等[47]开发了一种针对血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的CRISPR/Cas9系统，作为治疗AMD的一种替代策略。他们将特异性表达VEGFR2的SpCas9和gRNA包装到AAV1中，AAV1是小鼠血管内皮细胞转导的合适血清型。在玻璃体内注射双重AAV载体7 d后，他们观察到在氧诱导的视网膜病变小鼠模型中，激光诱导的CNV减少以及血管生成阻滞。

4 结语

运用基因编辑技术基因治疗并不局限于提供外源性转基因治疗单基因疾病这一单一现象。进行精确基因组修饰的治疗潜力极具吸引力，但在临床试验期间必须密切监测与CRISPR/Cas基础技术有关的安全方面[9]:AAV 持续存在并可能整合到DSB中; 全基因组非靶点; Cas9蛋白的免疫原性; 以及p53肿瘤抑制基因的激活。因此，改进给药方法，检测罕见突变和量化其潜在风险，抵抗免疫反应和凋亡信号将对未来的临床进展非常重要。尽管存在上述挑战，针对LCA10的基因编辑治疗目前正处于一期和二期临床试验，这表明CRISPR/Cas9系统治疗视网膜营养不良在安全性和有效性方面具有治疗潜力。