膀胱癌患者外周血CTC细胞中survivin的表达及意义

毛天赐，张伟，罗娟

1.空军军医大学唐都医院泌尿外科，陕西 西安 710038；2.西安市儿童医院耳鼻喉科，陕西 西安 710038

膀胱癌主要是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，在泌尿系统恶性肿瘤中十分常见。此病的发生与患者吸烟、职业接触等因素相关，临床上患者多出现血尿、尿频、尿急、尿流梗阻等症状，对其正常生活带来极大困扰，症状严重者危及生命[1-3]。膀胱癌患者较多数以浸润的方式生长，首次治疗后，具有较高的复发率，且患者远期生存率较低，血行转移主要以外周血中存在循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)为基础，是膀胱癌远处转移的主要途径[4-5]。而生存蛋白(survivin)是一种凋亡抑制基因，与肿瘤的进展、转移之间具有一定相关性[6]。本研究对膀胱癌患者外周血CTC进行检测，观察其survivin的表达情况，分析其与患者肿瘤直径、肿瘤分期等的相关性，进一步探究是否将其作为膀胱癌病情发展情况的监测指标，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择空军军医大学唐都医院于2019年1月至2020年11月期间收治的54膀胱癌患者为研究对象。其中男性40例，女性14例；年龄35～80岁，平均(57.50±3.22)岁。纳入标准：①经手术病理证实，确诊为膀胱癌；②未合并其他恶性肿瘤者；③同意纳入本研究。排除标准：①合并严重心脑血管疾病，肝肾功能不全者；②近期接受抗肿瘤治疗者；③具有精神类障碍，无法进行正常沟通交流者；④因其他原因中途放弃治疗者；⑤临床资料不全者。本研究经医院伦理委员会批准后实施。

1.2 观察指标与评价(检测)方法 比较不同肿瘤直径(<3 cm、≥3 cm)、病理分级(低级别、高级别)、肿瘤分期(T分期即

1.2.1 CTC检测 首先应用红细胞裂解液对采集的外周血样本进行处理，去除红细胞，之后以免疫磁珠分离法去除CD45+的白细胞。采取膜滤过法自白细胞中分离出CTC。最后，使用EDTA抗凝真空采血管再次采集膀胱癌患者10 mL的外周静脉血，将最初收集的2 mL去除掉，以轻柔的力度将其进行上下颠倒，使其处于混匀状态。将新鲜的血样样本放置于温度为0℃～4℃的环境中进行保存，在运输过程中，注意避免造成震荡、碰撞。将红细胞裂解液加入血样中，同样以轻柔的力度将其进行上下颠倒，使其处于混匀的状态；将其放置于室温环境中，持续5～8 min，至出现透明红的情况。之后进行4℃的离心，300×g，持续10 min，离心处理后，可见管底处有淡红色的细胞，呈团块状，将上清弃掉，之后加入4 mL的磷酸盐缓冲液(PBS)，将细胞重悬，并保持轻柔的动作，对其细胞团块进行上下捶打，使其呈分散状。重悬细胞后，将200µL抗CD45的免疫磁珠加入，并放置于温度为2℃～8℃的环境中进行孵化，持续30 min，在此期间，以轻柔的动作将其倾斜、旋转。选取上清液，使用PBS进行重悬，将抗CD45、抗CK8、染核试剂依次加入，并将其混匀，放置于室温内，持续30 min的孵化，CK8+CD45-DAPI+细胞便可被定义为CTC，使用24孔的5µm滤膜进行过滤，应用显微镜对不同型别的CTC进行观察。

1.2.2 survivin蛋白表达检测 于含有10%的胎牛血清RPMI-1640培养基、温度为37℃、5%CO2条件下，对CTC细胞进行培养。培养之后，应用丙酮进行相应固定，持续10 min，之后放置于温度为37℃、0.75%H2O2-PBS的环境中，持续浸泡30 min，再应用PBS进行振洗，之后将封闭血清加入，37℃持续30 min，将血清弃之，将比例为1∶100的survivin一抗加入，37℃持续30～60 min，再次使用PBS振洗，之后加入二抗，37℃30 min，PBS进行振洗，Tris-HCl缓冲液进行振洗，将新鲜的底物溶液浸入，之后进行水洗，将苏木素染液浸入，再用水进行清洗，快速过盐酸酒精，随后用水洗，再过氨水，之后水洗，脱水过二甲苯，进行封片，使用显微镜进行相应观察。

1.3 统计学方法 应用SPSS20.0统计学软件进行数据分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，计数资料比较采用χ2检验，均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC及survivin检测结果 54例膀胱癌患者中25例检出CTC，阳性率为46.30%(25/54)，主要包括13例上皮型CTC、7例间质型CTC、5例为混合型。上皮型CTC中7例为survivin阳性表达、占比53.85%；间质型CTC中均为survivin阳性表达、占比100.00%；混合型CTC中4例survivin阳性表达、占比80.00%。间质型CTC中survivin阳性率明显高于上皮型和混合型CTC，差异有统计学意义(χ2=5.765、4.605，P<0.05)。

2.2 膀胱癌病理特征与CTC阳性率的关系 肿瘤直径<3 cm、T分期0.05)，见表1。

表1 膀胱癌病理特征与CTC阳性率的关系[例(%)]

2.3 膀胱癌病理特征与survivin阳性率的关系 肿瘤病理分级中的高级别、T分期≥T2的survivin检测阳性率明显高于低级别及T分期0.05)，见表2。

表2 膀胱癌病理特征与survivin阳性率的关系[例(%)]

3 讨论

膀胱癌是临床上常见的泌尿系统肿瘤，具有较高的复发率，而肿瘤的复发、转移与其预后之间具有密切的关系[7-9]。因此，及时对此病进行正确诊断及治疗具有重要的临床意义。研究指出通过分析膀胱癌患者外周血CTC细胞中survivin的表达情况，有助于了解其表达阳性率与患者病理分级、分期、病灶大小之间的关系，从而判定患者病情发展情况[10-11]。另有研究显示，大约有半数的肌层浸润性膀胱癌患者在初期治疗时，可能会出现微转移的情况[12-13]。

CTC主要是由肿瘤原发灶肿瘤细胞脱落、诊疗操作时，释放入血液，随之会形成相应的肿瘤微转移灶，CTC主要是肿瘤发生相关血行转移的基础，在肿瘤转移中，是其必需的前提之一[14]。对患者外周血进行检测，若发现CTC，则可能会发生远处转移的风险，预后情况不佳。CTC主要可分为上皮型CTC、间质型CTC、混合型CTC，其中间质型CTC迁移、传播能力较强，具有更强的侵袭能力，通过观察其数量、表型的转变，可在一定程度上提示患者疾病进展、治疗的应答情况[15]。survivin属于一种细胞凋亡抑制蛋白，主要位于第17号的染色体长臂上，包括4个外显子、3个内含子，此物质对于细胞的凋亡具有一定抑制作用。survivin对细胞分裂具有调节作用，还可有效的参与至肿瘤血管生成过程，在膀胱癌组织中呈现为高表达[16]。有研究指出，若患者存在CTC，其数量越多则患者疾病的浸润性会越强，复发时间也就相应越短，从而会显著提高转移的概率，增加患者疾病风险[17]。本研究发现，54例膀胱癌患者中有25例检出CTC，阳性率为46.30%(25/54)；肿瘤直径<3 cm、T分期

本研究主要根据CanPatrol技术、免疫磁珠法、膜滤过法等技术对膀胱癌患者外周血中的CTC进行检测，与传统检测方法比较更加多样化，且优势更加明显，可以将白细胞进行更有效的去除，且去除率较高；此外，本研究所应用的检测方法可以对各种表型的CTC进行有效的收集，所收集的CTC细胞可在细胞培养、免疫荧光剂基因检测等检测中进行良好的运用，回收率更高[18]。54例膀胱癌患者检测结果显示，上皮型CTC中7例为阳性表达，占比53.85%；间质型CTC中均为阳性表达，占比100.00%；混合型CTC中4例阳性表达，占比80.00%。间质型阳性率显著高于上皮型和混合型CTC。这可能是由于，间质型CTC的侵袭性较高，可能与survivin的高表达具有相关性，survivin通过对细胞的凋亡进行有效的抑制，对于细胞的分裂、肿瘤血管生成具有促进作用，从而侵袭性显著增强。

综上所述，膀胱癌患者CTC细胞阳性率、CTC细胞中survivin阳性表达与其病理分级、分期、直径等之间具有一定相关性，可作为临床评估病情的有效依据。