室性心律失常的基因治疗进展

刘俊鹏 施海峰

室性心律失常(ventricular arrhythmia,VA)的治疗一直以来都是心律失常研究领域的难点与热点，目前主要的治疗手段包括抗心律失常药物、植入型心律转复除颤器和导管消融等[1-2]。然而，这些治疗方法均存在一定的局限性，如疗效欠佳、存在相关不良反应及风险仍较高等。近年来，随着以基因治疗为代表的生物治疗在单基因疾病领域取得成功，以及对VA致病基因及分子机制的认识不断深入，对于难治性的遗传性和获得性VA，基因治疗将可能成为一种具有广阔应用前景的治疗选择。本文就该领域的研究进展进行概述。

1 基因治疗概述

基因治疗是通过对靶细胞内某个基因的修复和(或)替换来增强、补充、校正或抑制该基因的异常表达，使其表达产物，即相应蛋白质的数量增加或减少，蛋白质功能增强或减低，从而影响疾病进程，最终达到治疗目的[3]。这项全新的概念于1972年由Freedmann和Roblin首次提出。不同于传统的小分子药物和抗体药物在蛋白质水平进行调控，基因治疗可在基因水平，即DNA或mRNA的水平发挥作用，因此对于致病基因明确而传统药物在蛋白水平难以发挥作用的靶点具有独特优势。由此可见，基因治疗的设计是基于一个假设，即在充分表征的生物途径中改变特定蛋白质，从而可能达到治疗效果。因此，深入了解疾病的病理生理机制对确定基因治疗策略(过度表达基因还是抑制基因表达)至关重要。

另外，为实现基因治疗，还需要载体和构建体两个关键部分。载体即基因递送系统，包括病毒载体和非病毒载体。随着不断开发和优化，载体系统已获得了重大突破，以腺相关病毒载体为代表的病毒载体成为主流。构建体是治疗成分，由启动子和核酸组成，其中，核酸包括cDNA、siRNA、miRNA或shRNA。近年来，在免疫缺陷、血友病和骨骼肌疾病的单基因疾病的研究中，基因治疗取得了重大突破；心脏及肿瘤领域的基因治疗已成为新的热点[3-4]。

2 基因治疗应用于遗传性室性心律失常

遗传性VA是由基因突变所致，这些基因突变增加了心律失常和心脏性猝死的风险。基因突变可导致离子通道疾病，如长QT综合征、儿茶酚胺敏感性多形性室速(catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia,CPVT)、Brugada综合征，也可导致心脏结构异常，如肥厚型心肌病、扩张型心肌病，或两种形式共同存在。常规的治疗方案不能从根本上减少心律失常的发作，但如果从基因水平进行干预，则有望使心律失常得到根治。

CPVT是以高猝死风险为特点的单基因遗传疾病，已知多种基因突变通过影响肌浆网钙通道蛋白RyR2的功能，破坏细胞内钙稳态，从而触发VA。近些年，基于CPVT的遗传学机制开展了不少基因治疗研究。Denegri等[5-6]率先将CPVT致病基因——心脏钙螯合蛋白基因(CASQ2)作为治疗靶点，开展基因治疗研究。他们将野生型CASQ2基因作为构建体、腺相关血清型9病毒(adeno-associated virus 9,AAV9)作为载体，注射到成年CASQ2基因敲除小鼠模型体内；20周后观察到钙螯合蛋白等表达水平正常化，CASQ2导致的电生理和超微结构异常得以改善，相关心律失常消失，首次证实了基因治疗的有效性[5]。随后，Denegri等[6]又针对成年CASQ2突变小鼠模型进行研究，同样发现小鼠的CPVT表型得到减轻。Bongianino等[7]针对RyR2突变基因开展基因治疗研究，他们采用RNA干扰技术抑制RyR2突变基因的表达，从而增强了野生型等位基因的表达。从研究结果看，野生型RyR2 mRNA的比例较突变型增加了1倍；蛋白定量显示，治疗后小鼠心脏中总RyR2水平降低了15%，心肌细胞电学活动及超微结构趋于稳定[7]。针对RyR2突变基因，还可以实施基因编辑技术。Pan等[8]通过AAV9在RyR2杂合突变小鼠中导入CRISPR/Case9和基因组RNA以纠正RyR2突变；结果显示，该治疗方法可有效抑制体内心肌细胞中引起疾病的等位基因的表达，心律失常的发生显著减少。钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是一种促肾上腺皮质激素激活的激酶，有致心律失常作用，是CPVT的潜在治疗靶点。Bezzerides等[9]基于CaMKⅡ抑制肽技术开展了基因治疗研究，以AAV9为载体，将CaMKⅡ抑制肽导入RyR2杂合突变小鼠中，发现心肌细胞心律失常表型受到抑制，心律失常发生率明显下降。

3 基因治疗应用于瘢痕性室性心律失常

缺血性心肌病或心肌梗死导致的瘢痕性VA，是最常见的恶性心律失常类型。它的发生机制是局部折返的形成，因此，改善瘢痕边界区域心肌的不应期及传导是此类心律失常治疗的关键。无论是抗心律失常药物还是导管消融，均是基于此机制发挥治疗效应的，然而这两种治疗方法均不能从根本上实现精准及持久的治疗。基因治疗从基因水平进行干预，理论上能从根本上改变心肌细胞的致心律失常机制，具有潜在的治疗价值。

早期的基因治疗专注于改善离子通路。Sasano等[10]在心肌梗死后室速的猪模型中，以腺病毒为载体，将编码KANH2钾通道的基因导入心肌梗死瘢痕区域，发现动作电位时程、有效不应期均明显延长，并且VA的发生率显著下降。近年来，通过改善细胞偶联、细胞兴奋性来恢复心脏传导逐渐成为新的研究热点。在心肌梗死后室速的猪模型中，Greener等[11]将缝隙连接蛋白43(Cx43)基因通过腺病毒导入心肌梗死的瘢痕边界区域，发现随着连接蛋白表达的增多，心脏传导得到恢复，与此同时VA的发生减少。同样，在小鼠模型中，使用慢病毒介导的Cx43基因治疗方法，也获得了相似的结果[12]。另外，采用骨骼肌钠通道伴或不伴缝隙连接蛋白32(Cx32)表达的基因治疗方法，其疗效也被一些研究所证实[13-16]。

综上，以基因治疗为代表的生物治疗近年来取得了重大突破，但在VA治疗领域，该疗法仍处在探索阶段。新型病毒载体的运用极大地促进了基因治疗在心律失常领域的应用。难治性的遗传性和获得性VA是基因治疗的合适靶点，然而，目前相关研究尚处在临床前阶段，动物模型多限于小鼠，缺乏心脏解剖，或是电生理更接近人类心脏的大型动物或灵长类动物的研究，使得基因治疗的有效性及安全性缺乏研究数据支持，尤其是难以评估致心律失常风险等。总之，生物治疗在不久的将来有望逐渐成为VA治疗的可选项，拥有十分广阔的应用前景。