鸡毒支原体检测技术研究进展

倪谷音，谢昊晋，金嘉旻，陆宇超，秦佳元

（1.无锡市动物园管理处，江苏无锡 214000；2.无锡市崇安区广益街道社区卫生服务中心，江苏无锡 214000；3.无锡市动物疫病预防控制中心，江苏无锡 214000）

1 鸡毒支原体分离培养

支原体分离培养较为困难。分离样本主要为气管、气囊、肺脏或鼻窦的分泌物，常用的分离MG的人工培养基有FM-4培养基、改良Frey氏培养基和PPLO培养基，并在培养基中加入20%的马血清或猪血清，而后根据培养后的菌落形态、菌体形状、生化特性结合血清学检测来确定。鸡毒支原体分离的菌落呈圆形，边缘整齐，透明，表面光滑，菌落中心色暗致密，边缘薄园，呈“荷包蛋”状。但该方法工作量大，耗费时间长，并不适合于生产上的快速诊断和监测。但某些时候如MIC测定，病原学研究等，需要获得鸡毒支原体菌株，就必须做支原体分离。AM Younis G等采用支原体分离和PCR技术分离和检测了埃及351份发病肉鸡样本，（其中227份为气管和气囊组织样本，124份为气管拭子），结果共分离到159株支原体（45.29%），其中鸡毒支原体100份（占分离总支原体量的62.89%）。Khalifa KA等从苏丹出现呼吸道临床症状的商业（蛋鸡和肉鸡）农场采集的气管拭子中分离到45个支原体分离菌株，其中8株为MG，3株为MS。

2 血清学检测技术

鸡毒支原体血清检测技术主要有血清平板凝集试验（SPA）以及酶联免疫吸附试验（ELISA）。其中ELISA是伴随着单克隆抗体技术产生的一种血清检测技术，特异性和敏感性较高，目前市场上也有很多商品化鸡毒支原体血清抗体ELISA检测试剂盒，比如美国的IDEXX，荷兰的BioChek以及我国的北京世纪元亨等公司。Ben Abdelmoumen Mardassi B等建立了一种基于重组抗原的酶联免疫吸附试验（recELISA），可用于同时和特异地检测三种主要禽支原体的抗体，特异性较高，适合于大量样本的筛查。Elyazeed HA等自制了一个鸡毒支原体ELISA试剂盒，与商品化试剂盒进行了对比，具有很好的相关性。王莉莉等利用鸡毒支原体重组热休克蛋白DnaK（rDnaK）作为包被抗原，HRP标记的兔抗鸡 IgG作为酶标二抗，建立了一种稳定检测MG抗体的间接ELISA方法。对该方法进行评估显示该方法不与NDV、IBV、ILTv等几种常见的禽呼吸道疾病的阳性血清发生交叉反应，特意性较高，重复性好，敏感性与进口商品化试剂盒相当，的总体符合率为90.4%。周云雷等以原核表达的PvpA蛋白作为包被抗原，建立了检测MG抗体的间接ELISA检测方法。该方法所用的重组PvpA蛋白与NDV、IBV、MS、大肠杆菌＂O＂抗原、禽沙门氏菌＂O＂抗原阳性血清均不发生交叉反应，特异性良好。用该检测方法与进口试剂盒对不同省份送检的鸡血清进行检测比较，结果两者阳性和阴性符合率均达到90%以上。血平板凝集试验目前使用的不是特别广泛，AM Younis G等同时采用血清平板凝集试验（SPA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）分别检测了71份血清的MG抗体，结果SPA法和ELISA法检测阳性率分别为54.9%和40.8%。

3 分子生物学检测技术

随着分子生物学技术的快速发展，不同形式的聚合酶链反应（PCR）技术，包括普通PCR，荧光定量PCR，多重PCR等，在鸡毒支原体检测中越来越广泛。其中套氏PCR和荧光定量PCR的敏感性和特异性较高。赵杰等以mgc2基因设计的引物建立的MG套氏PCR，能够扩增的基因片段的大小为300bp，与GenBank中收录的相关序列的同源性为98%，而与大肠杆菌、沙门菌、鸡滑液囊支原体均无交叉反应，能够检测出DNA的最小质量浓度为0.18fg/μL。周云雷等建立了基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。该方法具有很好的特异性，敏感性检测显示该方法最低检测限为72拷贝/20μL，敏感性比常规PCR100倍以上，重复性试验显示批内和批间变异系数均小于2%。

在临床诊断中，除考虑能否实现批量和快速分析以及敏感性和特异性外，兼顾鉴别诊断的检测技术越来越受欢迎。早在2000年，谢志勤等就建立了能够同时检测鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和禽衣阿华支原体的多重PCR检测技术。Fraga AP等建立了MG和MS多重荧光定量PCR技术，该技术在MG检测分析中的敏感性和特异性均为100%，在MS的分析中的敏感性和特异性分别为94.7%和100%，所以该方法非常适用于家禽业实验室的MG和MS批量和快速分析。由于活疫苗的广泛使用以及鸡毒支原体的多样性，临床上快速鉴别诊断疫苗株和野毒株的需求越来越多。Sulyok KM等根据MG的crmA、gapA、lpd、plpA、potC、glpK和hlp2基因的突变，建立的PCR方法能够区分鸡毒支原体疫苗株和临床分离株。Ghorashi SA等也建立了类似的方法，能够鉴别不同MG菌株。此外，研究人员还建立了其他特殊用途的关于MG的PCR检测技术，比如Tan CG等建立了基于支原体16S核糖体核酸（rRNA）的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），该技术与PCR联合应用可以检测和区分活的鸡毒支原体和死的鸡毒支原体。

研究显示，MG的PCR检测结果受咽拭子材料，病料保存方式以及抗生素治疗的影响。Christopher Ball等发现，塑料棉签拭子MG的分离率显著高于木棉签，4℃条件下的MG的PCR检出率高于室温条件。唐小飞等发现病料保存最有效的保存方法是将咽喉棉拭子置于甘油PBS中于-20℃冷藏或将干咽喉棉拭子放入-20℃中保存。同时，抗生素治疗会降低PCR的检出率，从而影响MG临床诊断，故在做实验室检测时，要充分考虑抗生素的影响。

4 鸡毒支原体各检测技术的相关性

鸡毒支原体不同检测技术具有一定的差异，所以不同地检测目的，需要选择适用的检测技术。Kahya S等利用31个祖父母鸡种群的646份血液和气管拭子样本比较了实时PCR（rPCR）和血清学以及培养方法的相关性。结果MG-RPA和HI的血清阳性率分别为48.4%（15/31）和32.3%（10/31），而培养阳性和rPCR阳性率分别为16.1%（5/31）和29.0%（9/31）。在群体分析中，培养法在MG血清阳性的鸡群中检测到5只（敏感性50%，特异性100%），而rPCR检测到8/10（敏感性80%，特异性95%）。血清学与培养、血清学与rPCR的符合率分别为83.9%和90.3%。在个体样本分析中，培养法在血清阳性鸡中检出26只（敏感性33%，特异性100%），而rPCR在78 MG血清阳性鸡中检出51只（敏感性65%，特异性96%）。血清学与培养、血清学与rPCR的符合率分别为91.9%和91.4%。