CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在肿瘤研究中的进展*

韩云蕾，郄蓓蓓,2，何艳洁，金 兵

1.成都医学院 基础医学院(成都 610500)；2.成都市石室天府中学 生物教研组(成都 610041)；3.唐山学院 环境与化学工程系(唐山 063000)

恶性肿瘤是严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一。根据国家癌症中心统计数据[1]显示，恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91%，2015年恶性肿瘤发病392.9万人，死亡233.8万人。随着多重基因分型和高通量基因组分析等测序技术的迅猛发展[2-3]，大多数癌症基因组的遗传变异已在结构上得到鉴定，但由于肿瘤的遗传异质性特点，筛选和鉴定新的肿瘤驱动突变和治疗靶点，仍是一项艰巨工作。2013年CRISPR/Cas9基因编辑技术(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease9，Cas9)被成功用于哺乳动物细胞基因编辑[4]，其后被广泛应用于癌症研究，通过特定基因的编辑了解该基因在肿瘤发生发展过程中的功能。本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术的最新特点及近年来在肿瘤研究中的应用进展方面作一综述。

1 CRISPR/Cas9基因编辑技术的特点

1.1 CRISPR/Cas9基因编辑技术基本原理

规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)于1987年在大肠杆菌中被发现[5]。根据核酸内切酶的识别及切割机制的不同，CRISPR系统分成5型，共16个亚型，其中Ⅱ型CRISPR系统依赖于单个Cas蛋白来靶向一个确定的DNA序列，因此展现出良好的基因编辑工具特性[6]。

CRISPR/Cas9基因编辑技术首先将crRNA与tracrRNA连接成为sgRNA(single guide RNA)并优化sgRNA结构，从而简化系统并提高Cas9与目标DNA的结合能力[7]。化脓性链球菌Cas9(SpCas9)在与sgRNA结合和激活后，通过sgRNA 5′端crRNA对目标DNA上核苷酸系列为NGG的候选识别位点毗邻基序(protospacer adjacent motif,PAM)前20个核苷酸系列进行识别定位，引导SpCas9蛋白特应性结合并发挥核酸内切酶活性，造成特定位点上DNA双链损伤(double strand break,DSB)[7]。

与通过调整蛋白锌指结构域或氨基酸模块来识别不同DNA序列的ZFN或TALEN基因编辑技术相比[8]，CRISPR/Cas9基因编辑技术通过sgRNA进行定位，对不同位置的识别仅需要调整sgRNA上前20个碱基，可降低哺乳动物基因编辑的工具构建成本和时间；同时CRISRP/Cas9基因编辑技术核酸内切功能(Cas9)与定位功能(sgRNA)相互独立的特征也与上述两种基因编辑技术不同，只需同时在细胞内表达Cas9蛋白和多条sgRNA，即可在同一细胞中同时进行多个位点的基因编辑，明显增加编辑效率和研究范围。此外，CRISPR/Cas9基因编辑技术识别的PAM序列在哺乳动物基因组中广泛存在，因此可编辑的位点也明显增加。

1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因编辑功能

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的基本特点，通过进一步对Cas9蛋白、sgRNA或编辑体系进行特定的改良，可使CRISPR/Cas9基因编辑技术完成多种不同基因的编辑。例如，基于CRISPR/Cas9对DNA造成的DSB的基本功能，以及哺乳动物的DNA损伤修复机制，就可实现对目标细胞的基因突变甚至染色体重组编辑。靶细胞对DSB有两种不同的修复机制。NHEJ是一种容易出错的修复机制，常常导致插入或删除，这些删除可导致目标基因发生移码突变、过早终止密码子和/或无义突变，从而导致基因功能丧失[9]。而同源重组修复是利用DNA模板进行同源重组来重建断裂的DNA。如果将CRISPR/Cas9基因编辑技术与预先设计的DNA同源重组模板同时转移到靶细胞中，则可通过这种机制来引入预先设计的突变[10]。此外，在同一条染色体上引入两个DSB，可诱导染色体大片段缺失，而在不同染色体上引入DSB，则可导致染色体重排[11]。

除了利用野生型Cas9进行定点的DNA切割外，利用修饰后核酸酶活性缺陷型Cas9(dCas9)融合和引导不同的调控蛋白，也可实现包括基因表达干扰(CRISPRi)、激活(CRISPRa)及表观遗传调控在内的多种不同形式的基因表达调控。在sgRNA的引导下，转录抑制因子融合蛋白dCas9-KRAB可被引导到目标基因启动子区域，通过直接抑制RNA聚合酶活性或修饰染色质，有效抑制目标基因的表达[12]。dCas9也可通过多种不同方式，参与激活目的基因。最早用于CRISPRa的是dCas9-VP64，通过在dCas9上融合1个VP64转录激活结构域，实现基因转录激活[12]，在此基础上，又发展出转录激活能力更强的dCas9-VP64-p65-Rra(VPR)[13]。除了直接融合转录激活因子外，也可通过改造dCas9和/或sgRNA实现多种转录因子的招募。这一策略的代表有SunTag和SAM，前者通过在dCas9上融合多个重复GCN4肽段，招募连接VP64的GCN4特异性单链抗体实现转录激活[14]；后者通过dCas9蛋白融合VP64转录激活蛋白，改造sgRNA使其可结合连接p65和HSF1转录激活因子的MS2蛋白，通过多种转录激活蛋白的协同作用，更好地模拟细胞内转录激活[15]。通过类似原理，dCas9与表观遗传调控蛋白的融合也可进行表观遗传调控。dCas9-DNMT3A或DNMT3A-DNMT3L融合蛋白，可选择性提高目标基因CpG区域甲基化水平，从而抑制基因表达[16]。相反，dCas9-TET1则可选择性抑制目标区域甲基化水平[17]。此外，dCas9-p300还可通过调控目标染色体区域组蛋白乙酰化，增加基因组相应区域的可及性[18]。

尽管传统的CRISPR/Cas9基因编辑技术可通过HDR引入定向突变，但额外引入DNA模板诱导HDR靶向效率较低。利用保留DNA单链核酸内切酶活性的Cas9-D10Anickase与碱基编辑因子的融合蛋白，可实现直接在DNA特定位置中引入单个碱基替换，而不需要外源DNA模板，这一技术被称为碱基编辑(baseediting，BE)，分为胞嘧啶碱基编辑(CBE)和腺嘌呤碱基编辑(ABE)，通过DNA目的链上对特定碱基的脱氨基作用，互补链上的单链损伤修复过程，分别实现C:G替换为T:A以及A:T替换为G:C[19-20]。除此以外，另一种被称为Prime editing的新型工具进一步拓展了CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用范围。该工具采用一种3′端增加了特定RNA模板的sgRNA(prime editing sgRNA, pegRNA)，融合了逆转录酶的Cas9 nickase，将预先设计的突变通过RNA模板逆转录整合到目标基因位置，因此，理论上可引入所有类型的基因突变，包括插入、缺失和点突变。研究[21]显示，Prime Editing除了顺利完成各种碱基替换外，还可引入长达44 bp的DNA插入以及80 bp的碱基删除。Prime Editing完全成熟后，将成为一个非常强大的系统，可在常规基因编辑系统不可能的水平上，轻松完成基因编辑操作，对肿瘤研究等领域意义重大。

2 CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤基础研究中的应用

肿瘤作为一种由累积的遗传/表观遗传异常导致的疾病，对其遗传特征的研究和突变基因功能的识别，对肿瘤疾病出现、发展的认识及治疗靶点的筛选有重要意义。CRISRP/Cas9基因编辑技术简单、高效及多功能的特点，使其迅速成为实验室常用的肿瘤遗传研究工具之一，在多个领域推动肿瘤基础研究。

2.1 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立肿瘤模型

肿瘤动物模型在肿瘤发生、转移、治疗等研究领域具有重要价值，但采用传统的基因改造技术建立动物模型，如基因打靶和插入突变，通常需要消耗巨大的工作量和时间。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，可直接通过受精卵注射Cas9 mRNA和sgRNA建立胚系突变的小鼠肿瘤模型。研究[22]报道，采用此技术同时靶向DNA甲基化酶Tet1和Tet2，在不到1个月的时间内产生两种基因双等位基因突变的小鼠效率为80%。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在动物肿瘤模型建立中，不仅可实现胚系突变，还可直接进行动物体细胞基因编辑，引入体细胞驱动突变，重现由少量乃至单克隆突变体细胞开始的肿瘤发生，模拟真实的肿瘤发生发展过程。在肝细胞癌小鼠肿瘤模型的建立中，常使用小鼠尾静脉高压注射将表达Cas9和靶向Pten、Trp53的sgRNA的质粒直接递送至小鼠肝脏[23]；在脑、肺、胰腺、结直肠、乳腺等其他器官的肿瘤模型中通过局部注射病毒载体、电穿孔等方式递送Cas9和靶向特定基因的sgRNA；此外，还可通过体外改造和回输的方式建立血液肿瘤模型[24]。

条件性基因编辑动物模型可研究基因改变在时间和空间上对肿瘤生物学过程的影响，将CRISPR/Cas9基因编辑技术结合到这一动物模型，可有效研究肿瘤驱动基因之间在时间和空间上的相互作用。例如，在KrasLSL-G12D/+、Trp53flox/flox(KP)条件性敲除小鼠中，通过慢病毒在气管内载入Cas9、Cre以及靶向Nkx2.1和Pten的sgRNA，显示引入Nkx2.1和Pten的突变小鼠肺腺癌发生时间早于KP突变小鼠，表明引入的突变在肿瘤驱动中的协同作用[25]；同样也可将Cas9作为条件性表达基因首先敲入动物基因组的策略来进行类似研究，在KrasLSL-G12D/+、R26LSL-Tom、H11LSLCas9(KT、Cas9)小鼠模型中，通过逆行胰管注射在胰腺中载入Cre和靶向Lkb1的sgRNA，在2个月内发展成胰腺肿瘤，并且与KT、Lkb1flox/flox条件性敲除小鼠表现出明显不同的组织学特征[26]。

2.2 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行肿瘤机制研究

肿瘤是一种遗传性疾病，在基因编辑模型中识别驱动肿瘤进展和维持的基因，在肿瘤机制和治疗研究中是非常重要的一步。CRISPR/Cas9基因编辑技术为这一领域的研究提供了一种便捷而有效的编辑工具。

除了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因突变功能，采用类似肿瘤动物模型建立的策略，每次对少量可疑基因进行肿瘤机制研究外，CRISPR/Cas9基因编辑技术也可用于操纵多个基因，以探索人类恶性肿瘤的遗传复杂性。在急性髓细胞白血病研究中，通过一对分别靶向RUNX1T1第1个内含子(位于8号染色体)以及RUNX1第5个内含子(位于21号染色体)的sgRNA，可以在1%～4%的细胞中诱导发生染色体重排，用于研究RUNX1T1-RUNX1融合基因在急性髓性白血病中的驱动机制[27]。髓系恶性肿瘤常由多个基因的改变驱动发生，在单个小鼠造血干细胞中修饰包括Tet2、Runx1、Dnmt3a、Ezh2、Nf1、Smc3、Trp53和Asxl1在内的多达5个基因的不同组合，观察小鼠髓系恶性肿瘤的发生，可重现和研究不同基因突变组合对肿瘤的诱导及其不同的病理特征[28]。

由于CRISPR/Cas9基因编辑技术定位仅取决于sgRNA，因此，该技术可作为一种高效的肿瘤驱动和耐药机制的筛选工具。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因敲除能力(CRISPRko)，在表达Cas9细胞中进行低感染复数感染，使每个细胞理论上可携带一个独特的sgRNA，通过细胞扩增和细胞sgRNA丰度检测，筛选相关突变基因。目前，通过CRISPRko基因编辑技术已筛选出与肺癌、胶质母细胞瘤、肝癌、直肠癌等多种肿瘤相关的不同肿瘤抑制基因[29]。在肿瘤研究中，非编码RNA的表达及启动子/增强子对基因的表达调控同样重要。有研究[30]表明，CRISPRi基因编辑技术在细胞系中对超过16 000种lncRNA进行筛选，并鉴定出其中499种与细胞生长相关的lncRNA。对肿瘤相关基因CUL3的ORF附近700 kb范围设计sgRNA进行CRISPRko筛选发现，对增强子区域的突变明显影响细胞对药物的耐受性[31]。CRISPRa基因编辑技术也可被用于与肿瘤耐药性相关筛选，例如dCas9-VP64基因编辑技术被Braun等[32]用于在B淋巴瘤细胞筛选与已知或未知的与耐药相关的DNA损伤修复基因。碱基编辑(BE)系统目前尚不能进行准确的碱基替换，但可利用其在编辑窗口内可诱导多个突变的能力来进行特定基因上的突变筛选。例如，Hess等[33]研究表明，利用dCas0-AID融合蛋白开发的CRISPR-X基因编辑技术，通过定制的sgRNA文库靶向PSMB5基因的全外显子范围，筛选与硼替佐米治疗相关的耐药突变。

2.3 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗靶点

与筛选抑癌基因的思路一致，通过CRISPRko基因编辑技术筛选癌细胞生长所必需，但对正常细胞不必要的基因，可鉴定出毒性和/或副作用较小的有效治疗靶点。通过该方法在5种急性髓性白血病(acute myelond leukemia,AML)细胞系中，鉴定出492中AML特异基因，其中许多基因可通过重新利用现有的抑制剂或进行新的小分子抑制剂的筛选而成为治疗靶点[34]。

由于肿瘤发生发展过程中特定的肿瘤抑制或激活基因的活性异常，导致生长代谢中以前非必须基因可能在肿瘤细胞中成为必须基因。因此，基于合成致死概念，也可在特定驱动突变的肿瘤中筛选特异的药物靶点。例如，在14种RAS突变或野生型AML细胞系中，通过CRISPRko系统筛选，发现包括PREX1在内的与RAS突变相关的合成致死基因，显示这些基因为新的药物靶点可治疗RAS突变型AML[35]。另一种筛选思路是通过在给予肿瘤药物治疗的条件下进行CRISPRko筛选，以鉴定与药物有合成致死能力的基因靶点或具有该药物耐药性的突变类型。Szlachta等[36]利用该思路在患者来源的胰腺癌中筛选与MEK抑制剂具有协同效果的潜在靶点，在体外筛选中发现多个潜在的靶点基因和信号通路。另一项在给予阿匹莫德治疗的淋巴瘤细胞中的CRISPRko筛选结果则显示，与溶酶体途径相关的基因突变，是增加肿瘤对该药物耐药性的重要原因[37]。此外，采用2个相关sgRNA进行联合式CRISPR筛选的方案，不仅可解析成对基因敲除的遗传相互作用，同时也可识别协同药物靶点。Han等[38]基于超过20 000对sgRNA文库，在AML细胞系中进行筛选发现，MLC1和BCL2L1在肿瘤生长中具有强相互作用，是潜在的联合治疗靶点。

免疫治疗现在已经成为重要的肿瘤治疗手段，但只有少数基因被发现与肿瘤细胞免疫逃避的内在机制相关，其中PD-L1在肿瘤细胞上的表达已经被证明在多种癌症类型中对免疫检查点抑制剂的反应相关，然而PD-L1在不同的肿瘤细胞内表达水平不同。因此，筛选和研究PD-L1表达的调节机制，不仅能更好地了解肿瘤生物学，而且能开发新的改善抗肿瘤反应的治疗策略。采用CRISPR/Cas9筛选肿瘤PD-L1表达调控因子的sgRNA文库构建与抑癌基因筛选的思路基本一致，然后基于PD-L1细胞表达模式的不同，通过流式细胞分选目的癌细胞。基于这一思路，Burr等[39]在一种胰腺癌肿瘤细胞系中，筛选到CMTM6基因作为一种新的细胞PD-L1表达调控因子。在免疫治疗中另一个重要的疗效影响因素是MHC-I的减少。在MHC-I低表达的K562细胞系中，通过CRISPRko筛选显示，靶向Eed、Ezh2、Ezh1和PRC2的细胞MHC-I表达量升高，显示MHC-I的表达调控与表观遗传调控密切相关[40]。

相同的思路也可用于动物模型肿瘤免疫微环境的研究中，通过分别在免疫正常和缺陷小鼠皮下移植经CRISPR筛选系统处理后的肿瘤细胞，对培养后采集到的肿瘤进行测序，从免疫活性动物癌细胞中缺失的sgRNAs推断特定的基因敲除对产生更强抗肿瘤反应的重要性。基于这一思路，有研究[41-43]报道，已鉴定出的Ptpn2等可能是肿瘤免疫治疗效果相关的新潜在靶点。另一方面，CRISPR/Cas9基因编辑技术也可用于研究肿瘤微环境中CD8+、CD4+或NK细胞等免疫细胞活性降低的作用机制。Dong等[44]通过在表达Cas9的CD8+细胞中注射sgRNA文库，并将编辑后T细胞输注到进行了皮下肿瘤移植的小鼠，发现RNA解旋酶Dhx37是调控CD8+细胞肿瘤浸润的关键因子。

3 CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤临床治疗中的应用研究

作为一种方便快捷的基因编辑工具，直接将CRISPR/Cas9应用于肿瘤临床治疗的尝试也一直未中断过。

3.1 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术纠正异常基因

直接通过CRISPR/Cas9纠正致癌基因突变或表观遗传畸变是肿瘤临床治疗的一个研究方向。在膀胱癌细胞模型中，通过肿瘤特异性的hTERT启动子和尿路上皮特异性的hUPⅡ启动子，分别控制sgRNA和Cas9在膀胱癌细胞中特异性表达，靶向激活p21、E-cad和hBax等肿瘤抑制因子，从而抑制肿瘤细胞生长[45]。但是，CRISRP/Cas9基因编辑技术的体内递送载体及其脱靶问题，一直限制着临床使用。此外，由于肿瘤在不同患者、不同阶段和不同位置上都存在异质性，使得肿瘤基因组操作具有很大的挑战性，而且，由于未编辑的肿瘤细胞比以治疗为目的的编辑细胞更具生长优势，因此该策略很容易导致治疗迅速失效。

3.2 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术清除致癌病毒

HPV、HBV、HCV、EBV等致癌病毒感染，是很多种肿瘤发生的关键因素，而CRISPR/Cas9基因编辑技术最初作为细菌的适应性免疫系统，具有防御和清除这些致癌病毒的潜力。以HBV为例，研究[46]显示，CRISPR/Cas9介导的HBVDNA突变，可在细胞和小鼠模型中有效清除或抑制病毒，其中基于TVHI递送至小鼠肝脏的靶向HBV的CRISPR/Cas9基因编辑技术，有效清除肝细胞内的HBVcccDNA。尽管这一策略可有效控制和清除致癌病毒，但除了CRISPR/Cas9基因编辑技术的递送载体限制外，病毒靶点的高度变异性也对这些治疗方法提出了挑战。

3.3 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术优化免疫治疗效果

在肿瘤免疫治疗中，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除包括PD-1基因和CTLA-4基因在内的免疫检查点相关基因，可提高肿瘤免疫治疗效果。这一策略的第一个临床试验在2016年已开始第一个患者的治疗，在多线治疗后的非小细胞肺癌患者中体外敲除T细胞PD-1基因，经体外筛选、扩增，然后回输入患者体内[47]。CRISPR/Cas9基因编辑技术在免疫治疗中，另一种临床应用策略是协助改造CAR-T等，通过对T细胞内源TCR、HLA-I以及PD-1的失活编辑[48]，乃至通过CRISRP/Cas9介导的HDR直接引入位点特异性CAR，提高CAR-T的制备效率。

4 小结与展望

自从CRISPR/Cas9基因编辑技术发展成为一种基因组编辑工具以来，它通过提供一种简单而多功能的方法来操纵基因组、转录组和表观基因组，从而彻底改变生物学。CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤机制研究、药物靶点筛选和临床治疗等肿瘤基础和转化医学研究领域中的潜力，正在开始显现。碱基编辑和Prime Editing等多功能CRISPR的技术发展，有助于改善通过同源定向修复进行精确基因改变效率低下的问题。例如spCas9-NG和xCas9等Cas9蛋白的进化改良，扩大了PAM序列范围及潜在编辑位置，并为未来减低编辑脱靶率提供了研究思路。saCas9、Cas13、Cpf1等其他类型Cas蛋白的研究和应用，可将增加CRISPR基因编辑载体的选择范围，提高编辑效率或增加编辑范围。此外，随着CRISPR基因编辑技术与单细胞RNA测序、单细胞追踪和表型分析平台的结合，将使研究人员能全面剖析肿瘤内在异质性，并揭示更多潜在的治疗靶点。总之，CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展已经并将继续大大加快诸多领域的肿瘤研究。