党参发酵优势菌种筛选及发酵产物的化学成分研究

黎氏大芳，张涵雪，高英鑫，杨雪晴，邱智东，徐 伟

（长春中医药大学·吉林长春·130117）

党参Codonopsis pilosula(Franch.）Nannf.为桔梗科多年生草本植物，清代《本草正义》记载党参具有补脾养胃，润肺生津，健运中气的功能。现代药理研究表明，党参药理作用广泛，对人体循环系统、免疫系统、消化系统、神经系统、内分泌系统、运动系统均有调节作用[1]，主要用于脾肺气虚，食少倦怠，咳嗽虚喘，气血不足等[2]。党参主要含有糖类、生物碱类、聚炔类、苷类及萜类等化学成分[3-9],具有调节免疫、调节肠胃功能、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[10]。中药生物转化技术是在继承中药炮制学发酵法的基础上，结合现代生物工程而形成的高科技中药制药新技术，具有安全性高、投资少、周期短、反应条件温和、稳定可控以及绿色环保等优势，可以作为一种有效方法应用于中药创新，已经成为中药产业新的增长点。本研究利用13种药用真菌，在前期实验的基础上结合生物转化技术对党参进行发酵，根据党参发酵情况，确定灵芝菌为党参发酵优势菌种。进一步对党参优势菌种发酵产物进行化学成分研究，从中分离得到5个化合物，分别是香草醛（1）、豆甾醇（2）、β-谷甾醇（3）、5α-25（R）-螺甾烷-1β,3α-二醇（4）和9,12-cyclomulin-13-醇（5）。化合物1-5的结构见图1。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DNP-9082BS-Ⅲ电热恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；YSQ-LS-50A型立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；LC-2130型日立高效液相色谱仪（上海天美科学仪器有限公司）；AVANCEⅢ600傅里叶变换核磁共振仪（德国Bruker公司）；BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；R-201型旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司）；KQZ3200E型超声波清洗机（天鹏电子新技术有限公司）。

1.2 材料

党参药材（批号：26018044）购于吉林省仙草医药药材有限公司，经长春中医药大学药学院翁丽丽教授鉴定为桔梗科党参属党参Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥饮片；牛肝菌、木耳菌、香菇、平菇、杏鲍菇、大青菇、白灵菇、树鸡、树舌、云芝、灵芝、灰树花、白树花（中科院微生物所）；柱色谱硅胶（100～200目，批号：0140027，青岛海洋化工有限公司）；ODS-C18填料（北京绿百草科技发展有限公司）；AM12S05-3010WT YMC-Pack ODS-AM半制备色谱柱（300 mm×10 mm，粒径：5μm，日本YMC公司）；所用试剂均为分析纯，由北京化工厂提供；液相用水为娃哈哈纯净水。

2 实验方法

2.1 党参发酵

2.1.1 种子液的制备

按照营养型培养基配方（葡萄糖2%，酵母粉0.2%，硫酸镁0.1%，蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾0.1%），在自然pH条件下制备液体培养基，接种牛肝菌、木耳菌、香菇、平菇、杏鲍菇、大青菇、白灵菇、树鸡、树舌、云芝、灵芝、灰树花、白树花菌丝，28±1℃培养至产生大量均一菌球。

2.1.2 菌种培养

将13种药用真菌菌球接入粉碎灭菌的党参药材中，28±1℃，65%RH避光培养，观察培养基生长情况。培养基生长情况见表1。

2.1.3 结果分析

通过表1可见，利用牛肝菌、大青菇、树鸡、香菇、灰树花和白树花未能发酵党参；利用白灵菇、树舌发酵党参，第2周发酵停止，且未发酵完全；利用木耳菌、杏鲍菇、平菇发酵党参，第3周发酵停止，且未发酵完全；利用云芝、灵芝发酵党参均能发酵完全，灵芝与云芝相比生长趋向于瓶底，生长状态更为旺盛，故确定灵芝菌为党参发酵优势菌种。

2.2 化学成分研究

2.2.1 提取分离

选择党参灵芝发酵产物5.0kg，7倍量70%乙醇加热回流提取3次，合并提取液，减压浓缩得到稠膏。稠膏与适量水混悬后依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取3次，分别得到石油醚部位65g、乙酸乙酯部位51g、水饱和正丁醇部位245g。

取乙酸乙酯部位浸膏，经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（100∶0、100∶10、100∶20、100∶50，V/V）梯度洗脱，得到54个流分，经薄层色谱检识后合并得到14个组分。其中，第2组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到化合物1；第12组分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到化合物2、3；第12组分经硅胶柱色谱后，再经半制备液相70%甲醇洗脱得到化合物4；第13组分经半制备液相85%甲醇洗脱得到化合物5。

2.2.2 结构鉴定

化合物1：黄色油状物，分子式C8H8O3。1H-NMR（CD3OD,600 MHz）:δ3.91（3H,s,-OCH3），6.91（1H,d,J=9.0Hz,H-5），7.42（1H,d,J=2.4Hz,H-2），7.42（1H,dd,J=2.4,7.8Hz,H-6），9.70（1H,s,H-7）。13C-NMR（CD3OD,150 MHz）:δ129.7（C-1），110.9（C-2），149.4（C-3），154.7（C-4），116.4（C-5），128.1（C-6），192.5（C-7），56.1（-OCH3）。以上波谱数据与文献[11]报道的基本一致，结合理化性质，故鉴定化合物1为香草醛。

化合物2：白色粉末，分子式C29H48O。1H-NMR（CD3OD,600 MHz）:δ1.05（3H,s,H-18），1.30（3H,s,H-19），2.37（2H,t,J=7.5Hz,H-7），2.80（2H,t,J=13.2Hz,H-4），3.62（1H,m,H-3），5.17（2H,m,H-22,H-23），5.18（1H,m,H-6）。13C-NMR（CDCl3,150 MHz）:δ38.2（C-1），31.7（C-2），71.3（C-3），41.1（C-4），139.8（C-5），117.7（C-6），34.4（C-7），34.4（C-8），49.7（C-9），36.8（C-10），21.3（C-11），39.8（C-12），40.7（C-13），56.3（C-14），24.9（C-15），28.7（C-16），55.4（C-17），12.3（C-18），19.9（C-19），40.5（C-20），21.6（C-21），138.3（C-22），129.7（C-23），51.5（C-24），32.1（C-25），21.8（C-26），19.2（C-27），25.6（C-28），13.3（C-29）。以上波谱数据与文献[12-13]报道的基本一致，结合理化性质，故鉴定化合物2为豆甾醇。

化合物3：白色粉末，分子式C29H50O。1H-NMR（CD3OD,600 MHz）:δ1.04（3H,s,H-18），1.27（3H,s,H-19），2.37（2H,t,J=7.5Hz,H-7），2.80（2H,t,J=13.2Hz,H-4），3.62（1H,m,H-3），5.37（1H,m,H-6）。13C-NMR（CDCl3,150 MHz）:δ37.4（C-1），31.7（C-2），71.3（C-3），41.1（C-4），139.8（C-5），117.7（C-6），34.1（C-7），34.1（C-8），49.7（C-9），36.8（C-10），21.3（C-11），39.7（C-12），40.7（C-13），56.1（C-14），23.2（C-15），28.2（C-16），55.3（C-17），12.3（C-18），19.9（C-19），36.4（C-20），19.1（C-21），33.9（C-22），26.4（C-23），46.1（C-24），29.9（C-25），20.0（C-26），19.2（C-27），23.2（C-28），12.1（C-29）。以上波谱数据与文献[14-15]报道的基本一致，结合理化性质，故鉴定化合物3为β-谷甾醇。

化合物4：白色粉末，分子式C27H44O4。1H-NMR（CD3OD,600 MHz）:δ0.89（6H,s,H-20,H-21），0.90（3H,m,H-27），3.65（1H,m,H-1），3.79（1H,m,H-16），3.85（2H,m,H-26），3.97（1H,m,H-3）。13C-NMR（CD3OD,150 MHz）:δ73.0（C-1），38.9（C-2），64.6（C-3），34.9（C-4），37.1（C-5），26.9（C-6），30.6（C-7），32.2（C-8），54.8（C-9），40.8（C-10），23.9（C-11），40.3（C-12），39.2（C-13），56.0（C-14），30.9（C-15），79.2（C-16），62.3（C-17），43.2（C-18），113.0（C-19），17.8（C-20），14.6（C-21），14.3（C-22），30.3（C-23），27.6（C-24），28.2（C-25），64.5（C-26），6.5（C-27）。以上波谱数据与文献[16]报道的基本一致，结合理化性质，故鉴定化合物4为5α-25（R）-螺甾烷-1β,3α-二醇。

化合物5：白色粉末，分子式C20H34O。1H-NMR（CD3OD,600 MHz）:δ0.60（1H,m,H-12），0.72（2H,dd,J=4.8,9.2Hz,H-11），0.82（3H,d,J=6.1Hz,H-18），0.89（3H,d,J=6.1Hz,H-19），1.06（1H,s,H-3），1.32（3H,s,H-16），1.34（1H,s,H-4），2.18（1H,dd,J=16.0,7.8Hz,H-10）。13CNMR（CD3OD,150MHz）:δ20.7（C-1），28.7（C-2），60.8（C-3），31.0（C-4），41.3（C-5），34.1（C-6），38.7（C-7），29.4（C-8），26.2（C-9），48.2（C-10），10.7（C-11），26.1（C-12），69.9（C-13），30.9（C-14），35.6（C-15），29.1（C-16），25.3（C-17），22.3（C-18），22.2（C-19），18.7（C-20）。以上波谱数据与文献[17]报道的基本一致，结合理化性质，故鉴定化合物5为9,12-cyclomulin-13-醇。

3 讨论

利用生物转化的方法处理中药，是发掘新的具有自主知识产权，具有中国特色的天然高活性先导化合物的重要途径。根据中药材选择特定的发酵菌种尤为重要，不同菌种在发酵过程中会产生特定的酶或类酶物质，使原有成分发生不同的氧化、水解、重排反应，从而改变原有化学成分的结构和性质，进而改变中药材原有的功效。本研究选择“3+1优化法”中初选、复选方法对党参发酵优势菌种进行筛选，确定了灵芝菌为党参发酵优势菌种，并从党参灵芝菌发酵产物中首次分离得到5个化合物，分别是香草醛（1）、豆甾醇（2）、β-谷甾醇（3）、5α-25（R）-螺甾烷-1β,3α-二醇（4）、9,12-cyclomulin-13-醇（5），其中化合物4、5在党参原药材中未见文献报道，为党参经生物转化产生。本研究为党参生物发酵及其产物的物质成分研究奠定了基础。