辐射花粉技术在西瓜单倍体培养中的应用

田花丽，黄冉涛，刘瑞，曹双，周青辉，张秋月，郭双双，范长有

（南阳市科学院，河南南阳473000）

西瓜果肉多汁，果皮可炒食，清凉爽口，具有一定药用价值[13]。利用单倍体育种技术和分子标记育种技术相结合的方法，可以减少不利影响因子的存在，大大减少培育自交系所需的时间和成本。采用辐射花粉技术培育单倍体植株可以克服离体雌、雄核诱导的弊端，在操作上省时省力。因此，利用辐射花粉培养单倍体以培育西瓜新品种，可助力西瓜产业的发展，具有重要的理论和实践意义。

1 单倍体及产生途径

单倍体（Haploid）是指体细胞中仅有配子染色体数目的细胞或个体，具有完整的遗传物质。将单倍体加倍后得到纯合双单倍体（DH），杂交后代显隐性突变都可表达，且性状可以稳定遗传，是获取突变体的最佳途径，也是研究基因功能的基础[1]。单倍体植株的基因来源相同，易建立进化树，可探索其亲本进化渊源关系，是分子标记技术的最佳材料。由于很多植物存在自交不亲和现象，很难从传统育种方式获得纯合体，单倍体的产生解决了这一问题。利用单倍体技术育种已经在辣椒、甜瓜、甘蓝、南瓜、黄瓜、西葫芦、玉米等作物上得到了验证[2-8]，该方法可以解决育种时间长、后代性状不稳定及任务量大等问题。因此，培育出单倍体后再进行杂交育种已经成为当今育种领域的首选。自然界中可以自发形成单倍体的概率极为低下，目前可获取单倍体途径主要有自发形成，如假受精、孤雌繁育、孤雄繁育等；离体培养获得，如离体小孢子培育、离体大孢子培育、辐射花粉或高频诱导花（原位诱导）。目前应用最多且最成熟的一种方法是离体雄核培育即小孢子培养技术，但有的作物不适用该方法[9]。通过花粉粒离体培养成功获得单倍体的先例出现在19世纪60年代[10]，葫芦科作物离体雌核诱导首次获得西葫芦单倍体植株是19世纪80年代[11-12]。辐射花粉或高频照射花需要人为采用某种射线干扰其正常的发育途径，损害正常的雌雄结合，使其形成单倍体。

2 单倍体培养技术在西瓜中的应用

目前，辐射花粉技术结合离体胚状体再生在黄瓜、甜瓜上取得了成功，该方法涉及到辐射源及辐射量、胚再生体系优化等技术，在西瓜单倍体诱导上值得效仿[13-15]。离体诱导外植体再生获得单倍体的体系尚不成熟，试验过程中涉及到供试材料的品种差异、发育状况、培养基类型及状态、外源激素的种类及浓度配比、培养条件等因素的影响，不可控因素多，难度较大。近年来，原位雌核辐射或高频诱导技术培育单倍体技术在国内外应用较多，此方法无需离体挑取胚，不伤害胚珠细胞发育，且污染率容易控制，但该技术体系还不成熟、稳定[19]。

3 影响辐射花粉诱导的因素

3.1 基因型

基因型是诱导单倍体是否成功的关键因素之一，这不单单存在于物种之间，在物种内部也较为明显。品系与花药、子房、胚珠等理化性质及抗逆性存在着相互关联，品系间存在差异[16]。刘晓辉[15]采用紫外照射西瓜花粉时发现，不同品系耐辐射情况不同，小瓜品系优于大瓜品系。因此，在获取单倍体植株过程中，方式各异，但基因型作为根本影响因子，严重影响着其诱导分化及成苗情况。根据现有数据进一步分析确定特异基因并探索其作用机理，在未来研究工作中值得探究。

3.2 授粉季节的影响

环境适宜可以使西瓜的生长达到最佳状态，雄核、雌核等的发育状态也最好[17]。龚思[18]在西瓜未受粉子房诱导时发现在秋季种植，日均温度在21℃~32℃之间时胚状体诱导率最高。杨红[19]采用γ射线辐射花粉，发现授粉11~12 d的果实发育最好。由此可知，高温时期选取开花前或开花初期的材料为外植体，可以提高诱导率。但高温高湿是瓜类各种病害如枯萎病、炭疽病等高发季节，应选择高抗的品种作为研究亲本。

3.3 辐射源及辐射量情况

辐射源有紫外照射、γ射线等，辐射量的选择因材料而异，在试验中起着至关重要的作用。辐射剂量高容易导致花粉粒死亡，辐射剂量低则达不到诱导单倍体的目的。因此，适宜的辐射量是试验成功与否的重点。刘晓辉[15]采用紫外辐射西瓜花粉得出45 min紫外辐射时花粉仅能存活下来50%，紫外90 min是最佳的辐射剂量。用γ射线辐射花粉粒可成功获得单倍体植株，裴晓利[22]采用γ射线辐照黄瓜花粉，辐射剂量为150 Gy，这与苏敏在西葫芦上的研究结果不一致[23]。杨红[19]采用γ射线辐射西瓜花粉发现辐射后11 d左右胚挽救成功率高。众多研究者发现辐射量在半致死量之上为宜，具体辐射剂量应根据试验情况来确定。

4 再生植株的倍性鉴定

任何途径获取的单倍体植株，其染色体倍性都不明确，需要选择合适的方法鉴别其倍性情况。精准的倍性鉴别是后期工作开展的前提。常用的植株倍性鉴定的方法有：①直接鉴别法，包括计量染色体数目法；②间接鉴别法，包括外观形态学观察法、叶片细胞鉴定法、流式细胞仪鉴别法。

单倍体植株整个生长周期长势均低于正常植株，可看到明显差异。所以在植株生长早期可通过观察法初步选出单倍体的植株。外观形态学观察法比较直接，主观性强，耗时。计量染色体数目法具有可靠、精确的特点[23]。流式细胞仪鉴定法是提取完整DNA，用特异的荧光染料对其进行染色，根据DNA含量来合理推测植株的倍性，简便、快捷、精确，但是费用高；叶片细胞鉴定法是根据叶片中气孔的形态、叶绿体数量等情况来鉴定植株的倍性。刘晓辉[15]采取根尖通过显微镜观察染色体数鉴定了再生植株的倍性；李玲[20]也采用计量染色体数目法鉴定出了再生苗的倍性；管苇[21]在黄瓜倍性鉴定中发现外观形态学观察法和叶片细胞鉴定法可作为黄瓜倍性鉴定的方法，且结果一致。

5 问题及展望

目前西瓜生产中多以高产、高抗品种为主，优质、特色、优良品种欠缺。利用辐射花粉诱导单倍体技术仍不成熟，体系不稳定，因此，应筛选优质基因型，确定适宜的辐射源和剂量，改进再生胚挽救体系，探索出成熟的辐射花粉诱导技术。采用原位辐射花粉诱导雌核，配合离体胚再生恢复技术，将是未来获得西瓜单倍体的一种可行性技术，可提供更多优质西瓜品种，从而加快西瓜产业发展。