婴幼儿鞋类产品橡胶部件中N-亚硝基胺假阳性的鉴别

周蓉 朱小芳 林东翔 陆婷婷 李燕

南京市产品质量监督检验院 江苏南京 210000

婴幼儿鞋是指鞋号不大于170mm，3周岁以下婴幼儿穿着的鞋。强制性标准 GB30585《儿童鞋安全技术规范》中要求，婴幼儿鞋橡胶部件中不应检出N-亚硝基胺。我国另外两个标准 GB25036-2010《布面童胶鞋》和GB25038-2010《胶鞋健康安全技术规范》，也规定婴幼儿鞋橡胶部件中N-亚硝基胺不得检出[1]。亚硝基胺化合物是具有-N-N=O官能团物质的总称，是一类很强的化学致癌物质。在已发现的300多种N-亚硝基胺化合物中，约有90%能使40种受试动物发生肿瘤[2]。

目前婴幼儿鞋类产品橡胶部件中N-亚硝基胺的检测依据是GB/T24153-2009《橡胶及弹性体材料 N-亚硝基胺的测定》，标准规定的仪器是气质联用仪[3]。气质联用法具有选择性好，灵敏度高，可直接用质谱定性等优点，但此方法也具有一定的局限性。气质联用法是根据各组分流经色谱柱后的保留时间，质核比信息与标准谱库进行匹配达到定性的目的，对于分子量相同化学性质相似的物质就很难达到很好的分离效果[4-5]。且气质联用法需要对样品进行高温气化处理，因此进样口温度很高，部分N-亚硝基胺会出现分解现象，从而生成新的N-亚硝基胺物质，易出现假阳性的问题。目前国内鲜有关于N-亚硝基胺检测假阳性分析的文章，本研究旨在建立一种对婴幼儿鞋类产品橡胶部件中N-亚硝基胺检测结果假阳性的快速筛查的方法，提高检测结果的科学性和准确性。

1 实验部分

1.1 实验仪器及试剂

仪器：气相色谱质谱联用仪5977A/7890B、1260Infinity II超高效液相色谱仪（安捷伦科技（中国）有限公司）；XS204电子天平（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）。

试剂：甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）（TEDIA试剂有限公司）；NMPhA标准物质、NMPhA标准物质、MPhA标准物质、EPhA标准物质（上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 标准工作溶液制备

分别准确称取每种N-亚硝基胺标准物质0.10g（精确至0.1mg），用甲醇定容至100ml容量瓶中，配制成浓度为1000mg/L的标准储备溶液，备用。

1.3 仪器分析条件

1.3.1 气质连用分析条件

毛细管柱：HP-5ms UI Inert（30m×250μm×0.25μm）；程序升温：柱温38℃，保持4min；以8℃/min的速率升温至83℃，保持4min；15℃/min的速率升温至300℃，保持6min；载气：氦气≥99.999%；流速：1.0ml/min；进样量：1μL；进样口温度：260℃；质谱接口温度：280℃；进样方式：不分流进样。

1.3.2 高效液相分析条件

色谱柱：Eclipse XDB C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇：水=65：35（体积比）；流速：1.0ml/min；检测波长：270nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

2 结果与讨论

2.1 气质联用法的鉴别

分别配制50mg/L的NMPhA、MPhA、NEPhA和EPhA的标准溶液，采用的方法进行测试

2.2 色谱柱型号对假阳性的影响

考察了弱极性色谱柱HP-5ms UI Inert（30m×0.25mm×0.25μm）和强极性色谱柱DB-WAX（30m×0.25mm×0.25μm）两种不同极性的色谱柱对NMPhA和NEPhA两种单标分离的影响。结果表明：在两种色谱柱中都出现了两个峰形尖锐的两个色谱峰，且其他并无响应面积能够匹配的杂峰出现，说明应是这两种N-亚硝基胺峰；但经过质谱确认发现在两种色谱柱中出现的两个色谱峰定性的结果均是MPhA和EPhA。说明在2.3.1的条件下，NMPhA和NEPhA 完全分解为MPhA和EPhA，HP-5ms UI Inert和DB-WAX两种色谱柱对N-亚硝基胺产生假阳性的结果没有直接的关系，通过色谱柱的优化不能够解决假阳性的问题。

2.3 进样口温度对假阳性的影响

按照2.3.1中的条件，HP-5ms UI Inert为色谱柱，选择对上述四种标准溶液进行测试。结果表明：NMPhA和MPhA的出峰时间和质谱图完全一样，NEPhA和EPhA的出峰时间和质谱图也完全一样，证明了按照GB/T24153标准规定的进样口温度为260℃时NMPhA和NEPhA完全分解为MPhA和EPhA。说明标准GB/T24153-2009《橡胶及弹性体材料 N-亚硝基胺的测定》的测试条件对于对NMPhA和NEPhA两种N-亚硝基胺的检测并不适用，在实际样品检测过程中，会造成假阳性的分析结果，导致检测结果的不准确。

为进一步研究进样口温度对NMPhA和NEPhA检测结果的影响，将进样口温度分别设置为100℃、120℃、150℃、180℃、200℃，220℃、240℃、260℃，测试结果：

由图1、2可以看出，NMPhA会在高温下逐渐分解为MPhA，NEPhA在高温下逐渐分解为EPhA。为了获得最佳的进样口温度，避免检测过程中出现假阳性，我们分别测试了在进样口温度分别为100℃、120℃、150℃、180℃、200℃、220℃、240℃和260℃的条件下，NMPhA、NEPhA两种标准物质的分解情况。结果见表图3。

图1 进样口220℃时NMPhA和MPhA色谱图

图2 进样口200℃时NEPhA和EPhA色谱图

图3 不同进样口温度下NMPhA、NEPhA的峰面积折线图

对于NMPhA，从图3中可以看出，进样口温度在100-180℃时，NMPhA的峰面积随着温度的升高不断增加，分解物MPhA的峰面积为零；当温度超过180℃之后，NMPhA的峰面积随着温度的增加不断减少，分解物MPhA的峰面积不断增加；当温度达到260℃时，NMPhA峰面积为零，分解物NMPhA峰面积达到最大值。

这是由于当温度较低时，NMPhA不能完全气化进入色谱柱被检测到信号，NMPhA峰面积响应较小；当温度达到180℃时，NMPhA刚好能完全气化进入色谱柱，此时NMPhA峰面积响应达到最大；当温度继续升高时，NMPhA开始逐渐分解为MPhA，因此NMPhA的峰面积不断降低，而分解物MPhA的峰面积不断增加；当温度达到260℃时，NMPhA完全分解为MPhA，此时NMPhA无响应，峰面积为零，而分解物NMPhA峰面积达到最大值。

对于NEPhA，趋势和NMPhA基本一致。进样口温度在100-180℃时，NEPhA的峰面积随着温度的升高不断增加；当温度超过180℃之后，NEPhA的峰面积随着温度的增加不断减少，分解物EPhA的峰面积不断增加；当温度达到240℃时，NEPhA基本完全分解，峰面积为零。

根据上述分析，当温度达到180℃时，NMPhA和NEPhA能够完全气化进入检测器而不产生分解，峰面积响应达到最大值，选择180℃为最佳的进样口温度。

2.4 高效液相法的鉴别

2.4.1 检测波长的选择

对NMPhA、MPhA、NEPhA 、EPhA四个标准溶液分别进行紫外光谱全波长扫描，这类物质在220-380nm范围内均具有较高的吸光度。

实验可知，NMPhA和MPhA的最大特征吸收波长不同，NMPhA在270nm处有强吸收，MPhA在240nm处有强吸收。为了更好的定性定量NMPhA，优先选择270nm为检测波长。实验发现，NEPhA的光谱扫描结果与NMPhA类似，EPhA的光谱扫描结果与NMPhA类似，综合考虑选择270nm为检测波长。

2.4.2 流动相的选择

分别考察了乙腈/水、甲醇/水两种流动相对NMPhA和MPhA、NEPhA和EPhA四种物质的的分离效果。结果表明，两种流动相均能够对上述四种物质进行分离。由于乙腈的淋洗能力较强，出峰时间短，四种物质的分离效果不如甲醇，且标准中样品前处理萃取溶剂为甲醇，因此综合考虑选择甲醇/水作为流动相。实验发现，当甲醇：水为65:35（体积比）时，在此条件下出峰时间较短，峰形完整，四种物质能够有效分离。

在上述优化色谱条件下，对浓度为1.0mg/L的混合标准溶液进行测定，图4是四种混合标准溶液的液相色谱图。结果表明，在选定的色谱条件下可以有效分离四种标准物质，其中NMPhA和NEPhA保留时间分别为4.320min和5.555min，MPhA和EPhA的保留时间分别4.707min和6.334min。因此通过高效液相法可以解决婴幼儿鞋橡胶部件中N-亚硝基胺气质检测中出现假阳性的问题[6]。

图4 NMPhA、NEPhA、MPhA和EPhA液相色谱图

3 结语

本文建立了婴幼儿鞋类产品橡胶部件中N-亚硝基-N-甲基苯胺（NMPhA）和N-亚硝基-N-乙基苯胺（NEPhA）两种N-亚硝基胺假阳性的鉴别方法。探讨了检测过程中产生假阳性的原因，提出如何避免在检测过程中假阳性出现的方法。

对于气质联用法，本研究选择180℃作为最佳进样口温度，避免NMPhA和NEPhA两种物质因高温分解而产生假阳性。对于高效液相法，本研究选择270nm为检测波长，甲醇/水（65:35）为流动相，高效准确的分离NMPhA和MPhA、NEPhA和EPhA四种物质，避免产生假阳性的结果。并通过两种方法的比较和分析，增加检测的准确性，避免检测过程中出现假阳性而影响检测结果的可信度。