Keratino Sens试验在医疗器械致敏性检测中的应用研究

陈 虹，黄元礼，王 涵，连 环，韩倩倩，王春仁

（中国食品药品检定研究院，北京 102629）

近年来利用人源细胞系来检测人体皮肤过敏源的体外试验方法日趋成熟，发展以人源细胞为基础的体外检测系统能最大化模拟人类皮肤致敏过程。皮肤中主要的免疫细胞是朗格汉斯细胞，但最先与应用于局部皮肤的化合物接触的是角质细胞，角质细胞参与免疫反应并产生许多细胞因子。角质细胞衍生的肿瘤坏死因子α在朗格汉斯细胞迁移的起始过程起了重要作用；同样，角质细胞也是IL-18的重要来源，IL-18是朗格汉斯细胞迁移诱导的关键调节因子。某些皮肤致敏物并不能与蛋白质直接反应，而只能作为前抗原（通过代谢活化成抗原）参与致敏，由于角质细胞具有内部的代谢活化作用使得角质细胞在致敏过程中成为一个重要的角色，因此基于人源角质细胞的检测方法——KeratinoSens试验被开发应用。

KeratinoSens试验由Givaudan公司开发，已于2015年被经济合作与发展组织（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）采纳为TG 442D指南文件。其原理是利用化学致敏物固有亲电性（或具备通过代谢将其转化为亲电性化学产品的能力），与皮肤中蛋白质反应后形成半抗原复合物，触发Nrf2-Keap1-ARE信号通路。构建含荧光素酶报告基因的KeratinoSens细胞系，在ARE控制下受诱导表达，其诱导表达程度通过测量荧光素酶与荧光底物反应得到的相对光输出量来确定。

构建细胞系的技术路线是首先合成人类

AKR1C2

基因ARE元件的两条互补DNA单链，将两条单链退火连接后接入载体pGL3的

Kpn

I和

Bgl

II两位点之间。随后将目标片段连同启动子SV40一同从载体pGL3上使用限制性内切酶切下，接入pGL4.17的

Kpn

I和

Hin

d III两位点之间，筛选回收后得到目标质粒并记为pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40。将目标质粒转染到人永生化角质细胞HaCaT细胞中，用G418筛选得到稳定转染的细胞系记为KeratinoSens细胞系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

HaCaT细胞，购于北京协和细胞资源中心；DH5α感受态细菌购于Solarbio公司。载体pGL3、pGL4.17、Bright-Glo荧光素酶检测系统购于Promega公司，限制性内切酶

Kpn

I、

Bgl

II、

Hin

d III购于NEB公司，α-MEM、PBS购于Hyclone公司，0.25%trypsin-EDTA、Opti-MEM购于Gibco公司，Lipofectamine2000、G418购于Invitrogen公司，凝胶DNA回收试剂盒购于AXYGEN公司，小量质粒抽提试剂盒购于北京庄盟科技有限公司，无内毒素质粒大提试剂盒购于天根生化科技有限公司，Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒购于Thermo Fisher Scientific公司。脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate，DOC）、三 氯 乙 酸（trichloroacetic acid，TCA）、磷钨酸（phosphotungstic acid，PTA），强致敏物二硝基氯苯（dinitrochlorbenzene，DNCB）、4-硝基苄溴（4-nitrobenzyl bromide）、对 苯 醌（p-benzoquinone），中等强度致敏物2-巯基苯并噻唑（2-mercaptobenzothiazole）、肉桂醛（cinnamic aldehyde）、β-大马酮（β-damascone）以 及 弱 致 敏 物α-己 基 肉 桂 醛（αhexylcinnamaldehyde）、对 氨 基 苯 甲 酸 乙 酯（ethyl 4-aminobenzoate），非致敏物十二烷基硫酸钠（SDS）均购自Sigma-Aldrich公司。

GloMax 96微孔板发光测试仪购于Promega公司，自动细胞计数仪购于Countstar公司，冷冻离心机、二氧化碳培养箱购于Thermo Fisher公司，紫外分光光度计购于Hitachi公司。

1.2 KeratinoSens细胞系的构建和鉴定

1.2.1 KeratinoSens细胞系的构建

合成含单个抗氧化元件（ARE）的两条互补核苷酸单链（上游5′-CTGGTCGCAAGGTGTGCAAGCTGCTGAGTCACCCTGA CTGCATCAACCCCAGGAGCTA-3′；下游5′-GATCTA GCTCCTGGGGTTGATGCAGTCAGGGTGACTCAGCAGC TTGCACACCTTGCGACCAGGTAC-3′）。稀 释 合 成 的DNA至20μL，使用上游引物、下游引物、10×NEBuffer 2各5μL，ddHO 10μL退火合成相应双链DNA。利用

Kpn

I和

Bgl

II对pGL3载体进行双酶切。双酶切体系（30μL）包括：限制性内切酶

Kpn

I和

Bgl

II各1.5μL、2μL载体pGL3、3μL NEBuffer 3.1、ddHO 22μL，于37℃反应4 h后置于冰上保存。将酶切后pGL3载体进行电泳及胶回收，按照凝胶DNA回收试剂盒（AXYGEN）说明回收DNA。回收后的双酶切载体pGL3和退火的ARE片段进行连接，反应体系（10μL）包括：1μL酶切后载体pGL3、2μL退火产物、2μL T4 buffer、1μL T4 ligase、4μL ddHO，室温下混匀，静置过夜，得pGL3连接产物。连接产物转化筛选后，挑取单克隆按照小量质粒抽提试剂盒说明书进行质粒小提并进行双酶切电泳鉴定。双酶切pGL3连接产物和载体pGL4.17，反应体系30μL：限制性内切酶

Kpn

I和

Hin

d III各1.5μL、pGL3连接产物和载体pGL4.17各2μL、ddHO 20μL，3μL NEBuffer 2.1，37℃反应2 h后4℃保存，酶切后胶回收。将目标ARE片段连同启动子SV40从pGL3-Promoter上使用限制性内切酶切下后，接入pGL4.17的

Kpn

I和

Hin

d III两位点之间，筛选回收后质粒小提并测序，测序结果经过PubMed比对工具BLAST与目的片段比对。将测序正确的小提质粒重新转化涂板并挑取单克隆菌落至100 mL LB培养基中，37℃条件下在180～200 r/min的摇床上振荡过夜。按质粒大提试剂盒说明进行质粒大提得到目标质粒pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40。

使用脂质体转染法将质粒pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40和对照载体pGL4.17转染HaCaT细胞。使用G418筛选细胞，大约10 d后对照组转染细胞全部死亡。得到稳定转染的细胞克隆使用Promega Glomax光度计测量，挑取荧光诱导值比仪器上限低2～3个数量级的克隆株。该试验挑取荧光读数6位且细胞状态良好的1株细胞进行扩增，得到KeratinoSens细胞系。采用此细胞系检测致敏性的方法称为KeratinoSens试验。

1.2.2 KeratinoSens细胞系的鉴定

选取OECD 429附录1和文献[4]验证的强致敏物二硝基氯苯、4-硝基苄溴、对苯醌，中等致敏化合物2-巯基苯并噻唑、肉桂醛、β-大马酮，弱致敏物α-己基肉桂醛、对氨基苯甲酸乙酯及非致敏物十二烷基硫酸钠，使用Givaudan的KeratinoSens试验对待测物进行测试。计算阴性对照组的变异度，测试细胞株的稳定性；对比试验结果与文献中上述待测物的致敏性能，得到KeratinoSens试验的致敏预测性。

每组试验细胞铺4块96孔板，其中3块白色板用于荧光素酶试验，1块透明板用于MTT试验。阴性对照使用含1%FBS培养基，阳性对照使用浓度为8 mmol/L的DNCB，每组试验重复3次。待测物溶于DMSO制成浓度为100 mmol/L的溶液。然后用DMSO连 续2倍 稀 释得 到0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25、50、100 mmol/L共10个浓度的样品。10个浓度样品均用含1%胎牛血清的培养基稀释25倍。将浓度1×10/mL的KeratinoSens细胞，每孔100μL接种于白色96孔板。每孔再添加100μL不含G418的培养基。放置于37℃、CO体积分数为5%的培养箱中培养24 h后，使用150μL含1%胎牛血清的新鲜培养基置换。将50μL含1%胎牛血清培养基的不同浓度样品添加到不同孔里，受试品终浓度从2～1 000μmol/L，DMSO终浓度1%。试验保持相同培养条件下，6孔阴性对照，6孔阳性对照，4孔空白对照。样品与细胞共孵育48 h后，使用PBS清洗细胞1～2遍。每孔添加50μL不含血清的培养基和50μL萤火虫荧光素酶报告基因检测系统液。室温避光孵育5 min，随后使用Promega Glomax光度计测试读数。同时，MTT法测试细胞活力。

1.2.3 计算及判定标准

基因活性诱导倍数=最大诱导值平均值/阴性对照诱导平均值；细胞活力

V

=

A

/

A

×100%，其中

A

为样品组吸光度平均值（扣除空白），

A

为对照组吸光度平均值（扣除空白）。

阳性化合物判定标准：在细胞活力大于70%时，有基因活性诱导倍数大于1.5；3组重复样品中，有2组以上样品判断为阳性；3组样品有相似的剂量反应曲线（随着浓度增加至细胞毒水平，基因活性诱导增加；与阴性对照比较，1.5倍基因诱导对应的浓度值相差不超过浓度序列里相邻两个浓度），阳性对照组有明显基因活性诱导倍数大于1.5的情况发生。按下式计算变异度（coefficient of variation，CV）。

细胞系稳定性判定标准：阴性对照组基因活性诱导值变异度小于20%；每个样品的剂量反应曲线有相似的趋势；阳性对照有明显的基因活性诱导倍数大于1.5的情况发生。

1.3 医用外科手套致敏性检测

1.3.1 蛋白抽提及浓度测量

样品1为一次性使用灭菌橡胶外科手套（高邦，桂林紫竹乳胶制品有限公司），样品2为一次性使用医用橡胶检查手套（AMMEX，越南制造），样品3为一次性使用橡胶检查手套（瑞京，北京瑞京乳胶制品有限公司）。胶乳手套参照医疗器械国家标准《GB/T 21870-2008天然胶乳医用手套水抽提蛋白质的测定》改进的lowry法抽提手套中水溶性蛋白。抽提液使用PBS。于25℃的条件下，恒温摇床以低速振荡抽提4 h。按照Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒说明书测试待测样品，使用紫外分光光度计在562 nm波长下检测蛋白浓度。

1.3.2 手套抽提蛋白KeratinoSens试验

超净台内无菌条件取3个手套样品的可溶蛋白抽提液。分别取抽提液20、40、60、80和100μL，依次按照本研究KeratinoSens试验加入96孔板相应的试验孔中，并补充含FBS的MEM培养液至每孔200μL，每孔FBS终浓度均为1%。放置于37℃、CO体积分数为5%的培养箱中培养48 h后取出测试。

1.4 金属镍致敏性检测

1.4.1 镍浸提及浓度测量

含镍金属参照医疗器械国家标准《GB/T 16886.12-2017医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品》进行浸提，样品1为正畸丝（3M，镍含量40%～50%），样品2为镍钛合金记忆合金棒（杭州启明医疗器械有限公司，经皮介入心脏瓣膜系统，镍含量40%～50%），样品3为镍粉200目（国药集团化学试剂有限公司）。

将3种样品各称量2 g，样品灭菌后用10 mL含2%双抗的MEM培养基浸泡于15 mL离心管中。离心管灭菌密封后，置于37%恒温水浴摇床浸提，镍粉浸提3 d，其余两种浸提90 d。

配制浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/mL的系列镍标准溶液。在232 nm波长下使用火焰原子吸收分光光度计绘制标准曲线，测量3份样品镍含量。

1.4.2 镍浸提液KeratinoSens试验

超净台内无菌条件取金属镍样品浸提液上清。分别取镍浸提液20、40、60、80和100μL，依次按照本研究KeratinoSens试验加入96孔板相应的试验孔中，并补充含FBS的MEM培养液至每孔200μL，FBS终浓度均为1%。放置于37℃、CO体积分数为5%的培养箱中培养48 h后取出检测。

2 结果

2.1 KeratinoSens细胞系鉴定结果

2.1.1 不同能力致敏物检测结果

高、中、低3种不同致敏力致敏物及1种非致敏物的KeratinoSens试验测试结果见图1。按照判定标准，基因活性诱导倍数大于1.5时，满足细胞活性大于70%，可判定为阳性；1种非致敏物，无基因活性诱导倍数大于1.5的情况发生，判定为阴性。与人类斑贴测试文献相比，结果预测全部正确。

图1 不同能力致敏物KeratinoSens试验结果

2.1.2 变异度计算结果

经计算本试验9个样品阴性对照组的平均变异度为18.6%，符合稳定性的要求。

2.2 天然胶乳手套致敏性检测结果

2.2.1 天然乳胶手套水溶性蛋白抽提浓度

3份手套样品水溶蛋白浓缩5倍后紫外分光光度计检测，经换算得到原始浓度，手套样品1浓度为0.008 mg/mL，样品2为0.008 mg/mL，样品3为0.004 mg/mL。

2.2.2 天然乳胶手套浸提液KeratinoSens试验结果

3份手套样品KeratinoSens试验检测结果见图2，基因活性诱导均无大于1.5倍情况发生，判断为阴性。

图2 3种天然胶乳手套KeratinoSens试验结果

2.3 含镍金属致敏性检测结果

2.3.1 金属镍离子浓度结果

经检测镍粉浸提液镍离子浓度较高，正畸丝和瓣膜材料合金镍离子浓度近似且较低。镍离子浓度检测结果分别为镍粉156.7mg/L、正畸丝0.984 mg/L、瓣膜材料合金小于标线最低浓度点。

2.3.2 金属镍KeratinoSens试验结果

3份不同镍离子浓度浸提液KeratinoSens试验检测结果（图3）近似，基因活性诱导均无大于1.5倍情况发生，判断为阴性。

图3 3种含镍金属浸提液KeratinoSens试验结果

3 讨论

本研究采用致敏物通过基因活性诱导1.5倍值做定性判断，在定量判断区分致敏物的强弱时，有文献提到强致敏物基因诱导1.5倍对应的化合物浓度一般小于10μmol/L；弱致敏物对应浓度一般大于50 μmol/L。如果以上可以作为一种定量标准，强致敏物4-nitrobenzyl bromide的基因活性诱导1.5倍对应浓度约为16 mmol/L，应被判定为中等致敏物；而中等致敏物β-damascone的基因活性诱导1.5倍对应浓度小于2 mmol/L，应被判定为强致敏物，其余化合物的判定与其致敏力基本相符。

KeratinoSens试验使用水相系统，对于无法溶解在适当溶剂的脂溶性化学物质很难正确评价。样品不溶或无法形成稳定的分散液会使得化学品难于在最高浓度测试。所以使用该系统评价的阳性结果可被识别为致敏剂，但阴性结果不能作为准确结论。OECD 442D也指出，选择性与赖氨酸残基反应的致敏物使用该方法也可产生假阴性结果。

一项由2 738例样本对天然胶乳IV型超敏反应的多中心研究结果显示，天然乳胶手套可引起IV型超敏反应。天然胶乳中水溶性蛋白质的总残留量与过敏反应出现的频率及严重性成正相关关系，其含有的水溶性蛋白质是引起过敏的主要因素。手套样品结果测试为阴性，尚需进一步研究。

有研究显示，在金属镍导致皮肤致敏的过程中，伴随活性氧离子将低价态二价的镍离子（Ni）氧化为Ni和Ni。说明镍的化学价态和微环境也是镍金属致敏的影响因素，推测镍反应阴性可能由于模拟金属镍致敏微环境不充分，导致结果为阴性。

由于致敏机制复杂，涉及树突状细胞、角质形成细胞、成纤维细胞相互作用，单独的体外测试无法覆盖致敏的全部步骤，也可能是导致天然胶乳和金属镍反应呈阴性的原因。已有文献使用包含Keratino Sens试验的组合策略对213种化合物进行测试，结果显示与人类斑贴试验数据比较，准确率高达90%。综上所述，我们认为可进一步使用组合策略对此两种医疗器械进行测试以观察效果，为KeratinoSens试验应用于医疗器械的致敏性检测提供经验数据。