泡桐花提取物抑菌抗炎活性评价

徐立丽 李丽妍

摘要 [目的]探究泡桐花资源在饲料添加剂中的开发利用。[方法]制备兰考泡桐花不同提取物，采用牛津杯法测定其抑菌活性，采用梯度稀释法确定其最小抑菌浓度。利用二甲苯致小鼠耳肿胀模型和LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型，评价泡桐花提取物抗炎活性。[结果]泡桐花水提物对金黄色葡萄球菌、四联球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用最为显著，其醇提物对白色念珠菌具有一定的抑制作用。泡桐花水提物的抗炎作用最佳，在试验浓度范围内2 mg/mL泡桐花水提物对细胞内炎症因子一氧化氮（NO）的清除能力最显著。[结论]泡桐花水提物具有较显著的抑菌抗炎活性，可作为理想的饲料添加剂加以开发。

关键词 泡桐花提取物;抗菌;抗炎

中图分类号 S-816.7  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）22-0170-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.22.042

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Evaluation on the Antibacterial and Anti-inflammatory Activity of Paulownia elongate Flower Extracts

XU Li-li LI Li-yan2 （1.Anshan Health School，Anshan，Liaoning  114000;2.Medical School，Huanghe Science and Technology University，Zhengzhou，Henan  450063）

Abstract [Objective]To investigate the development and utilization of Paulownia elongate flower resources in feed additives.[Method]Different extracts from P.elongate S.Y.Hu flowers were prepared.The antibacterial activities of the extracts were determined by Oxford cup method，and the  minimum inhibitory concentration （MIC） of the extracts was determined by gradient dilution method.The anti-inflammatory activity of the extracts was evaluated by using xylene-induced ear swelling model and LPS induced macrophage RAW264.7 inflammatory model.[Result]The aqueous extract from P.elongate flowers had the most significant inhibitory effects on Staphylococcus aureus，Mlicrococcus tetragenus，Escherichia coli and Salmonella paratyphi，while the alcohol extract inhibited on Candida albicans.The aqueous extract from P.elongate flowers had the best anti-inflammatory effects，2 mg/mL aqueous extract from P.elongate flowers had the most significant scavenging ability on NO as intracellular inflammatory factor within the experimental concentration range.[Conclusion]The aqueous extract from P.elongate flowers had significant antibacterial and anti-inflammatory activities，so it could be used and developed as an ideal feed additive.

Key words Extract from P.elongate flowers;Anti-bacterial;Anti-inflammatory

随着人们生活水平的逐步提高和对健康生活的不断追求，食品安全备受关注。针对食用动物产品药物残留超标及耐药性等问题的日益加剧，农业农村部2019年7月发出的第194号公告称在我国停止生产、进口、经营和使用部分药物饲料添加剂，并

于2020年7月1日起开始实施，这要求进一步提高动物营养与保健，调整饲料营养设计，选用新型绿色添加剂产品以替代原有抗生素，减少滥用抗生素造成的危害，维护动物源食品安全和公共卫生安全。

泡桐樹是我国资源非常丰富的速生型落叶乔木，泡桐属共7种植物，分别为毛泡桐、兰考泡桐、楸叶泡桐、白花泡桐、台湾泡桐、川泡桐和南方泡桐[1]。其中，兰考泡桐（Paulownia elongata S.Y.Hu）在我国河北、河南、山西、陕西、山东、湖北、安徽和江苏等地均有分布。泡桐一般花期在4—5月，泡桐花在春季开花时采收，资源丰富，晒干或鲜用[2]。关于泡桐花的大量研究集中于毛泡桐，毛泡桐花中含有黄酮类、有机酸、生物碱、氨基酸、蛋白质、挥发油、多糖、酚类及靴质类成分，其中糖苷类、黄酮类物质具有抗菌、止咳、消炎、平喘等作用[3-8]，但对兰考泡桐抗菌抗炎成分的研究报道较少[9]。为综合开发与利用泡桐花资源，减少滥用抗生素造成的危害，笔者以兰考泡桐花为研究对象，通过评价其抗菌、抗炎活性，分析其在动物饲料中作为添加剂应用的可能性和科学性。

1 材料与方法

1.1 试验材料 泡桐花采自校园内，泡桐种属经鉴定为兰考泡桐。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、四联球菌（Mlicrococcus tetragenus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella paratyphi）、白色念珠菌（Canidida albicans）等菌种均由黄河科技学院微生物实验室提供。昆明系小鼠购自郑州大学动物实验中心。小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系购自武汉Procell生命科技生物公司。

1.2 试剂 阿司匹林（aspirin）、营养琼脂、沙氏培养基均购自北京索莱宝生物科技有限公司，二甲苯购自天津科密欧化学试剂有限公司。DMEM培养基、青霉素、链霉素、EDTA-胰蛋白酶等均购自Gibco公司（美国）;胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.3 仪器与设备 生物安全柜（AC2-4S1），购自新加坡ESCO科技有限公司;细胞培养箱（IN75），购自德国Memmert贸易有限公司;隔水式恒温培养箱（GHP-9050）购自上海一恒科学仪器有限公司;空气恒温摇床（型号KYC-100C，上海福玛实验设备有限公司）;紫外可见分光光度计（722S），購自上海仪电分析仪器有限公司;多通道微孔板读板机（Envision），购自美国PerkinElmer公司。

1.4 方法

1.4.1 泡桐花提取物的制备。

1.4.1.1 水提物的制备。取200 g泡桐花置于通风阴凉处自然干燥后，粉碎至100目待用。取上述粉末40 g，加入蒸馏水，料液比为1∶15 （m/V），常温浸泡2 h后80 ℃下浸提1 h，过滤后留取滤液，滤渣以上述条件再浸提1次，过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏后冻干备用。

1.4.1.2 丙酮提取物的制备。

取上述制备的泡桐花粉末40 g，70%丙酮以料液比1∶8 （m/V）常温下浸提3 h，抽滤取滤液后，滤渣以上述相同条件再浸提3次，合并4次滤液，上清液于40 ℃下旋蒸浓缩至浸膏，冻干备用。

1.4.1.3 醇提取物的制备。

取上述制备的泡桐花粉末40 g，用70%乙醇室温下浸泡泡桐花粉末2 h，料液比为1∶14 （m/V），然后70 ℃下继续浸提1 h。抽滤分离上清液，滤渣以相同条件再浸提1 h，合并滤液后于40 ℃下减压浓缩至浸膏，冻干备用。

1.4.2 泡桐花提取物抑菌活性的测定。供试各菌种斜面活化后，挑取少量细菌菌落接种至100 mL营养肉汤培养基中，置于恒温振荡培养箱中培养12 h（37 ℃，120 r/min）;真菌接种至100 mL PDA液体培养基，并置于恒温振荡培养箱中培养12 h （27 ℃，150 r/min），备用。

采用牛津杯法测定提取物的抑菌活性。用无菌吸管取1 mL充分混合的菌悬液于试管中，加入无菌生理盐水，调整菌悬液OD600 nm至0. 以生理盐水作为空白对照。每板取1 mL菌悬液充分混合于相应固体培养基平板中。

称取适量提取物样品，分别用水配制浓度为100 mg/mL泡桐花水提物溶液，以0.5%DMSO配制浓度100 mg/mL的泡桐花醇提物和酮提物样品溶液。牛津杯中分别加入200 μL样品溶液，每个浓度样品重复3次，同时分别设置空白对照。37 ℃恒温培养箱中培养24 h，测量抑菌圈直径，结果取平均值。

1.4.3 泡桐花各提取物的MIC值测定。配制浓度分别为100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 mg/mL的提取物系列溶液，其中水提物用水溶解配制，醇提物和酮提物用0.5%的DMSO溶剂配制。用相应液体培养基调整上述制备的菌悬液OD600 nm为0. 于96孔板中加入90 μL/孔的菌悬液，再分别加入配制好的各浓度提取液10 μL/孔，混合均匀后放入培养箱中振荡培养12 h后，测定OD600 nm。每孔设3个重复，3次平行试验。以不含药品的营养肉汤或液体PDA为空白对照，测定最小抑菌浓度。

1.4.4 泡桐花提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀度的影响。

取雄性昆明系小鼠30只，随机分为空白对照组（生理盐水组）、阿司匹林组、泡桐花水提物组、醇提物组和酮提物组，每组6只。各组小鼠连续灌胃给药7 d，灌胃量为1 mg/g，阿司匹林组剂量为0.02 mg/g，末次给药前禁食不禁水12 h，末次给药30 min后，在每只小鼠耳廓两面均匀涂抹30 μL二甲苯[10]。以左耳作为对照，1 h后脱颈处死。剪下双侧耳廓，用6 mm打孔器在同一位置冲下两耳耳片，用电子天平称重，以左右两耳片重量之差表示耳部炎症的肿胀度，并按照以下公式计算肿胀抑制率（%）：肿胀抑制率=（空白对照组平均肿胀度 - 给药组平均肿胀度）/空白组平均肿胀度×100%。

1.4.5 泡桐花提取物对LPS诱导的小鼠巨噬细胞Raw264.7细胞系炎症反应的影响。

1.4.5.1 泡桐花提取物细胞毒性评价。根据“1.4.4”试验结果，选取泡桐花水提物和醇提物进行细胞水平炎症反应试验。CCK-8法用于评价2种提取物对小鼠巨噬细胞系RAW264.7的细胞毒性作用。细胞用含10%FBS、100 U/mL 青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM培养基在37 ℃培养箱中（5%CO 空气湿度95%）培养至细胞融合度至80%，消化铺板于96孔板，每孔100 μL，接种密度为2×104个细胞/孔。培养过夜后，分别加入泡桐花水提物和醇提物，系列浓度为1、2、4和8 mg/mL，以不加泡桐花提取物的组作为空白对照组。培养24 h后加入10%CCK-8工作液，继续培养1 h后，测定OD450 nm。按照以下公式计算细胞存活率（%）：细胞存活率=（OD空白对照组-OD药物组）/OD空白对照组×100%。

1.4.5.2 泡桐花提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞系一氧化氮（NO）产生量的影响。将细胞融合度80%的细胞板以2×105个细胞/mL的密度铺96孔板，每孔100 μL。过夜后分为LPS组（终浓度为0.5 μg/mL）、LPS+阿司匹林组（LPS、阿司匹林终浓度为20.0 μg/mL）、LPS（终浓度为0.5 μg/mL）+泡桐花水提物组（终浓度分别为0.5、1.0、2.0 mg/mL）。不加任何药物的细胞作为对照组。细胞培养24 h后取培养液，4 ℃ 下1 000 r/min离心10 min，取上清，用于NO含量测定。

Griess法测定NO含量（Sittisart 等[11]），以浓度3.125～100.000 μmol/L的NaNO2绘制标准曲线，计算样品培养液中NO含量。以NO2-的质量分数为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线相关方程为y=0.039 4x+0.069 4（R2=0.999 1）。

2 结果与分析

2.1 兰考泡桐花不同提取物的得率 兰考泡桐花水提取物得率为11.20%，70%乙醇提取物得率为10.59%，70%丙酮提取物得率为8.95%。

2.2 泡桐花不同提取物抑菌試验结果 泡桐花不同提取物的抑菌试验结果见表1。由表1可知，兰考泡桐花不同提取物对金黄色葡萄球菌、四联球菌、大肠杆菌和沙门氏菌均具有一定的抑制作用，泡桐花醇提取物对真菌白色念珠菌有一定的抑制作用。提取物在相同浓度下，对革兰氏阳性菌四联球菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果最佳，对革兰氏阴性菌大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用次之。由此可见，泡桐花不同提取物对革兰氏阳性菌的抑菌效果最为显著。

2.3 MIC测定结果 泡桐花不同提取物的最小抑菌浓度结果见表2。由表2可知，泡桐花水提物对细菌的抑制作用最为显著，其对四联球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的MIC值分别为6.25、6.25、25.00、25.00 mg/mL。泡桐花醇提物对真菌白色念珠菌的MIC值为50.00 mg/mL。总体而言，泡桐花不同提取物对以四联球菌和金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌的MIC值较小，即抑制效果最为显著，对革兰氏阴性菌的MIC值次之，对真菌的MIC值最大，即最不敏感，这种抑菌效果的差异性可能与革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌细胞结构组成不同相关。此外，水提物的抑菌效果比其醇提物和酮提物略好，可能与其水提物中的糖苷及黄酮苷类成分较多有关。

通过对以上试验结果分析可知，兰考泡桐花水提物的抑菌活性较为显著，且泡桐花水提物在工艺上易于提取，泡桐花提取物可作为一种较为理想的替代抗生素类成分的植物饲料添加剂。

2.4 泡桐花提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀度的影响 泡桐花不同提取物对小鼠耳肿胀的抑制程度见图1。由图1可知，20 mg/mL的泡桐花水提物、醇提物和酮提物下肿胀抑制率分别为62.31%、32.30%和31.14%，而4 mg/mL阿司匹林组肿胀抑制率为79.50%。泡桐花水提物的肿胀抑制率明显高于其醇提物和酮提物，与空白对照组相比各试验组均存在显著差异（P<0.05）。

2.5 泡桐花提取物对LPS诱导的小鼠巨噬细胞Raw264.7细胞系炎症反应的影响

2.5.1 泡桐花提取物的细胞毒性。

泡桐花提取物对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性结果见图2。由图2可知，0.5和1.0 mg/mL的泡桐提取物对细胞存活率几乎没有影响，2.0 mg/mL的泡桐水提物对细胞存活率也几乎没有影响，存活率为95.61%，而该浓度下泡桐花醇提物的细胞存活率降至91.50%。随着泡桐花水提物和醇提物浓度的增加，细胞存活率呈现逐渐降低的趋势，4.0 mg/mL的泡桐花水提物组细胞存活率降至80.20%，而泡桐花醇提物组细胞存活率降至75.60%。相同浓度下，泡桐花水提物对细胞毒性的影响更低。鉴于此，选取2.0 mg/mL作为泡桐花水提物的最大试验浓度，考察其对细胞炎症模型的抗炎作用。

2.5.2 泡桐花提取物对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞系NO产生量的影响。一氧化氮（NO）作为细胞内的介质，在LPS刺激的炎症部位释放，这可能导致严重的炎症和内毒素血症[12-13]。 因此，在炎症刺激下抑制NO的产生是减轻炎症反应的有效策略。据报道，植物黄酮对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞产生NO有抑制作用[14-16]。因此，NO作为一个炎症介质指标，被用于考察泡桐花水提物的抗炎活性。由图3可知，0.5 μg/mL的LPS诱导巨噬细胞RAW264.7可以显著提高其NO水平，说明炎症模型制备成功，而泡桐花水提物处理后NO产生量显著下降，且随着泡桐花水提物浓度的升高，NO产生量呈剂量关系。2.0 mg/mL泡桐水提物可以降低NO产生量，接近20 μg/mL阿司匹林的作用结果。

3 讨论与结论

为开发新型食用动物饲料添加剂，笔者选取资源丰富的兰考泡桐花进行研究。结果表明，泡桐花不同提取物对细菌的抑制能力以其水提物最为显著，且其对以四联球菌和金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌的抑制效果好于以大肠杆菌和沙门氏菌为代表的革兰氏阴性菌。同时，泡桐花各提取物对白色念珠菌类真菌的抑菌试验中发现泡桐花的醇提物在大剂量下可抑制白色念珠菌的生长。这些抑菌效果的不同可能与细菌和真菌细胞壁结构的不同相关，相对于泡桐花醇提物和酮提物，其水提物中含有大量的可溶性糖苷类、黄酮苷类、有机酸、生物碱类化合物，而大量研究表明糖苷类化合物具有抗菌活性[17-18]。对中草药饲料添加剂的开发研究也发现，具有良好抑菌功效的活性物质主要有多糖、酚类和萜类等物质，通过改变细胞膜的通透性，抑制和调控细菌遗传物质的表达而起到抑菌作用[19]。这也可以印证泡桐花水提物抑菌效果好于有机溶剂提取物的现象。

在动物模型抗炎试验中也发现，泡桐花水提物的效果好于有机溶剂提取物，可能也与其含有较多的可溶性多糖和黄酮苷类成分有关。因此，后续细胞验证模型仅考察泡桐花水提物的抗炎活性。NO是一种自由基气体，巨噬细胞的防御功能即是通过NO介导的，因此NO可作为细胞因子在炎症反应中扮演重要的角色[20]。NO在體内或水溶液中极易氧化成NO2-，因此可以利用其与Griess试剂反应生成的产物浓度与NO浓度具有线性关系，在540 nm处检测NO的表达量，而促使NO表达量下调的药物则意味着其具有抗炎活性。动物模型和细胞模型试验结果均表明泡桐花水提物具有良好的抗炎活性，且2.0 mg/mL的泡桐花水提物与20 μg/mL的阳性药物阿司匹林的抗炎活性接近，均可以显著下调LPS诱导的NO大量表达。

此外，泡桐花水提物显著的抑菌抗炎活性对于其在饲料添加途径的可操作性也较为突出，即泡桐花作为添加剂的直接添加或者制备水提物的添加方式均比有机溶剂提取物的添加方式更加方便、安全且环保。这对于其作为动物饲料绿色添加剂的开发是极为有利的。该研究也将深入挖掘其抗菌抗炎的单一组分，有待进一步的机理研究。

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