盐度胁迫对细鳞鲑幼鱼呼吸代谢和抗氧化酶活性的影响

杜佳玉 吴晗阅 孟照勇 李雪东 文逊智 王茂林

摘要 挑选平均体重（4.0±1.4）g、平均体长（8.0±1.2）cm的细鳞鲑（Brachymystax lenok）幼鱼，研究了不同盐度（0、6、12、18、24、30）对细鳞鲑幼鱼鳃丝和肝脏中Na+-K+-ATP、抗氧化酶（SOD、CAT）活性的影响。结果表明，不同盐度对细鳞鲑幼鱼鳃丝中Na+-K+-ATP活性及肝脏中抗氧化酶活性有显著影响（P<0.05）。随着盐度的升高，细鳞鲑鳃丝和肝脏中的Na+-K+-ATP活性升高，抗氧化酶（SOD、CAT）的活性则随着盐度的升高而降低。虽然细鳞鲑能够通过自身的渗透调节和抗氧化系统应对外界盐度变化带来的压力，但是长期的盐度胁迫也会给细鳞鲑幼鱼机体带来损害。研究结果为今后细鳞鲑的耐盐度选育、养殖推广等方面的工作提供了一定的理论依据。

关键词 盐度胁迫;细鳞鲑幼鱼;Na+-K+-ATP;SOD;CAT

中图分类号 S-917.4  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）22-0114-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.22.027

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Salinity Stress on the Respiratory Metabolism and Antioxidant Enzyme Activities of Brachymystax lenok Juvenile

DU Jia-yu  WU Han-yue  MENG Zhao-yong 2 et al （1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North Chinas Sea，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023; 2. Key Laboratory of Applied Biology and Aquaculture of Fish in Northern China，Liaoning Province，Dalian，Liaoning 116023）

Abstract Brachymystax lenok juvenile with the average body weight of （4.0±1.4） g and average body length of （8.0±1.2） cm were selected to study the effects of different salinity （0， 1 18，2 30） on the activities of Na+-K+-ATP and antioxidant enzymes （SOD，CAT） in the gill filament and liver of B.lenok juvenile.The results showed that different salinity had significant effects on the activity of Na+-K+-ATP in gill filaments and the activities of antioxidant enzymes in the liver of B.lenok juvenile（P<0.05）.With the increase of salinity，the activities of Na+-K+-ATP in gill filaments and liver increased，while the activities of SOD and CAT decreased with the increase of salinity gradient.Although B.lenok could deal with the pressure caused by the changes in external salinity through its own osmotic adjustment and antioxidant systems，long-term salinity stress could also cause the damages to the body of B.lenok juvenile.The research results provided certain theoretical basis for the future work on the selection of salinity tolerance，breeding and promotion of B.lenok.

Key words Salinity stress;B.lenok juvenile; Na+-K+-ATP;SOD;CAT

細鳞鲑隶属于硬骨鱼纲鲑形目鲑科细鳞鲑属，一般分布于渭河上游及其支流和汉水北侧支流湑水河、子午河上游的溪流中，常年水温不宜超过20 ℃。细鳞鲑由于其肉质细嫩，脂肪含量高，具有较高的经济价值。同时，细鳞鲑作为国家二级保护动物，在鱼类学和动物地理学上也具有重要的学术研究价值 。细鳞鲑虽然属于淡水鱼类，但对盐度具有一定的耐受性。盐度是影响鱼类生长发育和生理变化的重要因子[1-3]。盐度胁迫会导致鱼类机体的氧化酶和Na+-K+-ATP酶发生一定程度的改变。渗透调节的能力与Na+-K+-ATP酶有关，测定Na+-K+-ATP酶的活性可以了解鱼类在盐度胁迫下渗透调节的能力[4-8]。CAT和SOD等抗氧化酶具有清除机体自由基的功能，提高鱼体的免疫调节能力[8-10]，因此研究盐度胁迫对细鳞鲑幼鱼酶活性的影响，有利于了解细鳞鲑在盐度改变时作出的应对机制，提高细鳞鲑的健康养殖技术。

1 材料与方法

1.1 试验材料 细鳞鲑幼鱼由本溪恒仁渔众不同家庭农场有限公司提供，均为人工繁育的细鳞鲑幼鱼，在大连海洋大学爱尼实验室人工循环水槽中暂养3 d，养殖水温为（7.0±0.3）℃，pH为（7.5±0.4）。每天24 h连续充氧保持富氧的环境。

1.2 预试验和试验设计 将同一批次的幼鱼置于盐度为0（对照组）、6、12、18、24、30的循环水槽中，暂养24 h内观察细鳞鲑幼鱼的状态，计算幼鱼的存活率。预试验结果表明，细鳞鲑幼鱼在0～30盐度下均能存活。

选取在暂养条件下健康状况良好的细鳞鲑幼鱼，置于试验所需的循环水槽内。缓慢调整盐度梯度，每天提高水体的盐度从2至30，保持24 h富氧环境。在0、6、12、18、24、30盐度下取样，每个盐度设置3个平行试验。

1.3 样品的制备和采集 从每个盐度下取3尾细鳞鲑幼鱼，用MS-222麻醉剂麻醉后，取其肝脏和鳃丝。每尾鱼的肝脏和鳃丝分为3份，将其分别置于预冷的离心管中，做好标记后保存于超低温冰箱中（-80 ℃）。样品前处理：准确称取组织重量，按照组织重量（g）：生理盐水体积（mL）=1∶9的比例配制成10%的匀浆，2 500 r/min（CAT活性测定时转速为10 000 r/min）离心10 min，取上清液再用生理盐水稀释成不同的浓度，探索最佳取样浓度（组织的最佳取样浓度按1%进行）。测定Na+-K+-ATP酶和抗氧化物酶所需的试剂盒为南京建成生物工程研究所提供的SOD试剂盒、ATP试剂盒、CAT试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒，测定步骤严格按照说明书进行。

1.4 指标的测定

1.4.1

超氧化物歧化酶（SOD）的测定。采用羟胺法测定超氧化物歧化酶活性。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，550 nm下比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，计算被测样品的SOD活性。

1.4.2 过氧化氢酶（CAT）活性测定。过氧化氢酶在一定条件下使底物过氧化氢分解，使其在反应液中的浓度逐渐降低，在240 nm处测定过氧化氢酶的活性。

1.4.3 Na+-K+-ATP活性测定。ATP酶可分解ATP，生成ADP和无机磷，在660 nm处测定无机磷的量，从而测定ATP活性。

1.5 数据处理 采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理与分析，对测得的试验数据进行单因素方差分析，差异显著性分析采用Duncan多重比较，结果均以平均值±标准误表示。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同盐度对细鳞鲑幼鱼肝脏和鳃丝中Na+-K+-ATP活性的影响

如图1～2所示，除对照组（CK）外，随着盐度的增加，细鳞鲑幼鱼肝脏中Na+-K+-ATP活性呈上升趋势，对照组（盐度为0）Na+-K+-ATP活性显著高于盐度为12时（P<0.05）;对照组Na+-K+-ATP活性为（6.32±0.39）U/g，是盐度12时的1.86倍。除对照组外，随着盐度的增加，细鳞鲑幼鱼鳃丝中Na+-K+-ATP活性呈上升趋势，盐度为0（CK）和30时Na+-K+-ATP活性显著高于盐度为6和12时（P<0.05）;盐度30时肝脏中Na+-K+-ATP活性最高，为（2.95±0.34）U/g，是盐度6时的2.78倍。试验初期当盐度发生变化时，

细鳞鲑幼鱼鳃丝和肝脏中的Na+-K+-ATP活性降低，但随着盐度的递增，细鳞鲑幼鱼鳃丝和肝脏中的 Na+-K+-ATP活性回升，表明在盐度梯度变化时Na+-K+-ATP酶参与细鳞鲑的渗透调节来维持机体内环境的稳定。

2.2 不同盐度对细鳞鲑幼鱼肝脏和鳃丝中CAT活性的影响 如图3～4所示，随着盐度的升高，细鳞鲑幼鱼鳃丝中过氧化氢的含量增加，反映出CAT酶活性呈下降趋势。当盐度为30时细鳞鲑幼鱼鳃丝中H2O2含量最大，为（115.73±14.90）U/g，是对照组（CK）的9.59倍，是盐度6时的2.32倍，这表明在盐度为30时细鳞鲑幼鱼鳃丝中CAT活性最低;细鳞鲑幼鱼肝脏中CAT活性差异显著（P<0.05），随着盐度的增加，H2O2含量增加，反映出CAT活性呈下降趋势。对照组（盐度0）与盐度为6、12和18时细鳞鲑幼鱼鳃丝中H2O2含量差异不显著。盐度为30时细鳞鲑幼苗肝脏中H2O2含量最大，为（63.28±7.27）U/g，是对照组的7.39倍，是盐度18的8.25倍，这表明在盐度为30时幼鳞鲑幼鱼肝脏中CAT活性最低。

2.3 不同盐度对细鳞鲑幼鱼肝脏和鳃丝中SOD活性的影响 如图5～6所示，不同盐度下细鳞鲑幼鱼鳃丝中SOD活性差异不显著（P>0.05），不同盐度下细鳞鲑幼鱼肝脏中SOD活性差异显著（P<0.05）。随着盐度的增加，细鳞鲑幼鱼肝脏中SOD活性呈下降趋势，对照组细鳞鲑幼鱼肝脏中SOD活性最高，盐度为30时细鳞鲑幼鱼肝脏中SOD活性最低，对照组细鳞鲑幼鱼肝脏中SOD活性是盐度30时的1.5倍。

3 结论

该试验结果表明，随着盐度的增加，细鳞鲑幼鱼鳃丝和肝脏中Na+-K+-ATP活性先降低再逐渐回升，SOD和CAT的活性随着盐度的增加而降低。在鳃丝中，Na+-K+-ATP酶在不同盐度梯度下差异性比超氧化物歧化酶和过氧化氢酶高。鳃是鱼类调节外界生活水域与体内离子水平的重要器官，Na+、K+是鳃中最重要的调控离子，Na+-K+-ATP酶为Na+、K+离子调控提供动力。因此，当外界的盐度梯度发生变化时，细鳞鲑幼鱼鳃丝中Na+-K+-ATP活性也会发生相应的变化。细鳞鲑幼鱼能够通过自身的渗透调节、Na+-K+-ATP活性变化和抗氧化系统（主要是CAT、SOD），应对外界盐度变化带来的压力，但长期的盐度胁迫也會给细鳞鲑幼鱼机体带来损害。

4 讨论

鱼类在适应外界环境盐度变化时会产生各种生理生化反应，导致体内的渗透压和抗氧化酶活性的改变[11-12]。鱼类为了维持体内渗透压的稳定必须进行渗透压调节，鱼类渗透压调节的能力决定了其对盐度的耐受能力。当外界的盐度发生改变，鱼类可以通过调节Na+-K+-ATP的活性来适应外界环境的变化[13]。该试验结果表明，随着盐度的逐渐增加，Na+-K+-ATP活性的改变呈现出先降低后逐渐升高，最后恢复正常的趋势。外界盐度升高时，鱼类体内的钠离子和氯离子需要进行跨膜运输，Na+-K+-ATP为细胞内离子的跨膜转运提供能量[14]。研究表明，当鱼类遭受盐度胁迫时，机体内与渗透压相关的Na+-K+-ATP会发生显著变化，Na+-K+-ATP在机体渗透压的调节和离子平衡上起到关键作用[15]。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）是评价鱼类非特异性免疫的重要指标，是机体抗氧化防御系统中重要组成部分。当盐度升高时，鱼体内会产生大量的过氧化氢和超氧阴离子，这些活性氧会损伤鱼类细胞，进而对鱼类的生理机能造成损伤[16]。超氧化物歧化酶和过氧化氢酶可以降低这些自由基对鱼类细胞的损伤[17]。孙梦蕾等[10]对红鳍东方鲀肝脏中的SOD和CAT活性研究发现，在低盐胁迫下SOD和CAT的表达量明显高于对照组。该试验结果表明，鱼类在高盐和低盐胁迫下，其过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性均会增加，因此SOD和CAT的活性可反映鱼类细胞的受损程度。王晓杰等[18]对许氏平鮋的研究表明许氏平鮋血液中的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的活性随盐度的降低呈现上升的趋势。该试验结果表明短期的盐度梯度变化会使细鳞鲑幼鱼抗氧化酶活性增高。

盐度作为一种生态因子，通过改变鱼类的渗透压来影响鱼类的呼吸、代谢和酶的活性。目前的研究表明对鱼类的渗透调节已达到分子水平。有多种基因参与到鱼类的渗透调节，跨膜蛋白基因（NKA基因）参与硬骨鱼类渗透调节钠离子运输的活跃泵，调节钠离子和氯离子的双向载体交换蛋白基因（NHE基因）[19]。在萨罗罗非鱼和尼罗罗非鱼的肠道和鳃等组织中检测出水通道蛋白的表达。水通道蛋白基因（APQs基因）不仅对水和离子的转运起到重要作用，而且参与甘油和尿素的转运，对鱼类的渗透压调节具有重要意义[19]。随着生物信息技术的发展，对鱼类渗透压调节的研究将进入数据化、信息化时代。

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