云南省江城县小反刍兽疫的血清学及分子流行病学调查

付 偲，李东鹏

（江城县动物疫病预防控制中心 665000）

小反刍兽疫也被称作羊瘟，属于接触性、急性传染病，疫病特征有发热、坏死性口腔炎、鼻部与眼部有脓/浆液性分泌物、支气管肺炎、胃肠炎等，此病发作后期会由于动物继发寄生虫或细菌感染等引起死亡，且死亡率非常高，容易给养殖人员带来巨大经济损失。小反刍兽疫病原是副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒，包含显著的上皮组织嗜性与淋巴组织。小反刍兽疫病毒粒子主要成分有大蛋白、磷蛋白和核衣壳蛋白等，整体呈圆形。病毒有四个基因系，而血清型只有一个[1]。此病毒主要会感染绵羊、山羊，其病理变化以及临床症状类似于牛瘟，抗原性接近于RPV，具备血清学交叉保护功能，可造成牛不排毒、无症状的自然感染。在小反刍兽疫防疫中，主要可通过牛瘟病毒疫苗预防此疫病，因此很多地区与国家不关注进一步研究与防控小反刍兽疫，同时因为小反刍兽疫病毒会不断变异，牛瘟病毒疫苗难以持续发挥交叉保护作用，使得小反刍兽疫在亚洲、非洲多个区域快速扩散。我国的小反刍兽疫疫情主要从西向东不断扩散，云南发病数量最多。小反刍兽疫病毒一般只繁殖于细胞中，对自然环境不具备很强抵抗力，且对强酸、强碱、高温都有较高敏感度。一般在50℃环境中，只需1h即可杀灭病毒，同时在pH值小于4.0或者大于11.0条件下也会失活，不过该病毒耐低温，可长期存活于冷冻、冷藏组织中[2]。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1待试样本

试验中血清样本以及羊眼拭子分别采集于2018年、2019年、2020年云南省江城县26个规模养殖场和38个散养户，包含707份血清样本和100份羊眼拭子样本。采集全血后1500r/min离心5min获取血清，羊眼拭子加入适量生理盐水，将处理好的样本保存在-20℃环境中，以供备用。

1.1.2 试剂与仪器

（1）核酸提取试剂盒: 西安天隆科技有限公司， 批号20091710T015；（2）小反刍兽疫病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒: 青岛立见诊断技术发展中心，批号201811-20100、020171901、020171905、020172005；（3）反应体系试剂盒: One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit，宝生物（大连）有限公司，批号AIG0899A；（4）核酸提取仪: 西安天隆科技有限公司，型号NP968-C；（5）荧光PCR仪: 美国 BIO-RAD公司，型号:CFX-96 ；（6）酶标仪: 赛默飞世尔（上海）仪器有限公司，型号MUItiskanFc。

1.2 试验方法

1.2.1 以ELISA检测血清抗体

根据ELISA抗体检测试剂盒的说明书开展血清抗体测定工作，OD值主要通过酶标仪读取，进而对血清阻断率（PB）数值进行科学计算。PB=100-（样本血清OD值/酶标抗体平均OD值）×100%。若PB值＞50，结果为阳性；若PB值≤50，结果为阴性。

1.2.2 以RT-qPCR检测病原

1.2.1.1 提取RNA

将羊眼拭子从冰箱取出回到室温，然后在震荡器上充分混匀，根据说明书要求提取RNA，放在-80℃环境中冻存以备用，或者马上进行反转录。

1.2.1.2 RT-qPCR扩增

根据说明书配置反应体系，其中2xOne Step RT-PCR BufferⅢ（10uL）、TakaRa Ex Taq Hs（0.4uL）、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ（0.4uL）、上引物（0.5uL）、下引物（0.5uL）、引物探针（0.5uL）、RNase Free dH2O（8uL）、模板（2uL）。反应条件: 42℃30min；95℃ 10min；95℃ 15S，共55个循环；60℃ 1min。对PCR扩增产物展开琼脂糖凝胶电泳（10g/L），利用凝胶成像系统观察[3]。

2 试验结果

2.1 不同年度的小反刍ELISA免疫抗体监测结果

于2018年、2019年、2020年从云南省江城县26个规模养殖场和38个散养户中采集707份血清样本展开ELISA免疫抗体监测，得出2018年当地小反刍兽疫抗体合格率是76.19%，2019年合格率是77.14%，2020年合格率是82.27%，总合格率是78.22%。具体见表1。

表1 2018～2020年云南省江城县小反刍兽疫ELISA免疫抗体监测结果

2.2 不同养殖类型的小反刍ELISA免疫抗体监测结果

当前该地区既有规模养殖类型，也有散养类型，但整体畜禽养殖规模化程度较低，多以农村散养为主。通过分析2018～2020年监测数据，可发现规模养殖场以及散养户其小反刍兽疫免疫抗体整体合格率分别是74.22%、80.95%，两者相比散养户合格率更高，原因可能与当地养殖场数量较少有关。详细结果见表2。

表2 2018～2020年云南省江城县不同养殖类型的小反刍兽疫ELISA免疫抗体监测结果

2.3 不同年度的小反刍兽疫RT-qPCR病原检测结果

于2020年在云南省江城县随机采集100份羊眼拭子进行检测，结果均为阴性，表示当地养殖羊没有感染小反刍兽疫病毒。

3 讨论分析

小反刍兽疫属于一种具有很强传染性的疾病，是小反刍兽疫病毒所引发的，具有很高的感染率，且动物感染后期常会因继发寄生虫感染或细菌感染出现死亡，整体死亡率非常高，当前世界动物卫生组织要求一旦发现此病都要及时上报[4]。通过2018～2020年的系统性监测调查，发现当地小反刍兽疫免疫抗体平均合格率为78.22%，达到我国农业农村部要求，且检测中未发现小反刍兽疫病毒，证明此地区还未受到小反刍兽疫病毒感染，当地开展的小反刍兽疫免疫以及相关防控工作较为有效，并且疫苗免疫措施对养殖动物产生良好保护作用。但总体来说，免疫抗体合格率水平并不算高，需要小反刍兽疫免疫工作加大工作反思，找到免疫漏洞，努力提升免疫合格率。

通过对不同年度以及不同养殖类型的养殖户展开小反刍兽疫ELISA免疫抗体监测，根据相关数据，发现从2018年至2020年免疫抗体合格率呈逐年上升趋势，且散养户免疫抗体合格率普遍比规模场养殖户合格率高。通过分析，总结出以下几点原因: ①云南省江城县7个乡（镇）多处于山区半山区，村落分布较散，畜禽养殖规模化程度较低，多以农村散养为主，所以规模养殖场缺乏养殖经验，饲养管理制度尚不完善，对免疫工作缺乏足够重视度。而因为当地散养户较多，受到疫病防控人员的高度关注，日常对散养户会进行较多宣传与教育，使其更重视疫病免疫工作；②部分免疫人员在对疫苗作出稀释操作后没有及时免疫，在气温较高环境中没有严格按照要求冷藏保存，进而直接影响免疫效果；③该县地处中、老、越三国交界处，国境线长达158.742km，有4个边境乡（镇）与老挝越南接壤，边境一线没有天然屏障，民间通道较多，边民长期共同放牧，交往频繁，影响动物疫病防控效果；④近年来，随着社会经济的快速发展，牧民们有更多途径和渠道增加收入，相比之下养殖收入普遍不高，影响牧民养殖积极性，对畜禽免疫工作缺乏关注度，不注重动态跟踪免疫效果，出现免疫效果不佳或漏免情况也不及时补免[5]。

经过此次对云南省江城县地区展开小反刍兽疫的血清学及分子流行病学调查，发现当地小反刍兽疫免疫防控工作依旧有较大提升空间，日常工作中不仅要做好饲养管理和免疫工作，还要对畜禽加强检疫，留种畜禽必须为没有感染小反刍兽疫病毒且免疫抗体合格的动物。同时，要对边民共同放牧情况加大控制力度，做好疫病控制宣传教育，在引入外部动物过程中需严格落实隔离观察政策，从根本上避免病原传入本地。