动物源性食品中氯霉素残留免疫分析技术研究进展

范素菊 李 嘉 杨兴东

1.周口职业技术学院农牧工程学院，河南周口 466000；2.周口师范学院食品药品检验检测中心，河南周口 466001

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一种抗菌类药物，因其作用谱广，价格低廉，广泛应用于我国的动物生产中，防止各种动物疾病的感染[1-2]。大量的研究表明，CAP 进入动物体内并造成残留，CAP 在人体的残留会抑制人体造血机能、增强细菌耐药性和引起机体的菌群失调等，甚至会引起致命的“灰婴综合征”[3]。因此，包括中国在内的许多国家均明确规定在动物源性食品中禁止使用CAP，我国农业部规定动物源性食品中CAP 的最高残留限量为不得检出。但在实际的动物生产中CAP 的滥用仍然存在，监控动物源性食品中CAP 残留是必不可少的[4]。目前，常用的检测动物源性食品中CAP 残留的方法主要包括色谱分析法（Chromatographic analysis）和免疫分析法（Immunoassay）。

1 色谱分析法

在气相色谱（Gas chromatography，GC）[5]、气质联用（GC-mass spectrometry，GC-MS）色谱[6]分析时，由于CAP 不易挥发，在测定前需进行衍生化。因CAP有很强的紫外吸收，可直接采用液相色谱（High per⁃formance liquid chromatography，HPLC）及液质联用（HPLC-MS）进行测定[7-8]。色谱分析虽然具有很高的灵敏度，但是其具有测定程序繁琐、专业性强和检测费用高等缺点。Jian 等[9]开发并验证了一种通过HPLC-MS 测定肉中CAP 的简单、环保、可靠的方法。首先用乙二胺四乙酸-McIlvaine's 缓冲液萃取样品，然后使用新型核-壳聚苯胺/聚丙烯腈纳米纤维垫通过固相萃取进行纯化，该法的检测限为0.01μg/kg，可用于对猪肉、鸡肉和牛肉中CAP 残留的测定，结果与中国国家标准方法相吻合，证明了该方法的可靠性和实用性。

2 免疫分析法

免疫分析法的核心是基于抗原（Antigen，Ag）、抗体（Antibody，Ab）特异性反应[10]。其中，目前应用最为广泛的免疫分析方法是酶联免疫法（Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）和侧流免疫检测法（Lateral flow immunoassay，LFIA）。近年来，基于核酸适配体建立的分析技术为快速检测的进一步发展注入了新的活力。

2.1 抗CAP抗原的合成和抗体的制备

免疫分析方法的基础是获得优质、高效的抗体，而抗体又从抗原免疫动物所得。CAP 的相对分子质量只有323.14，仅有反应原性，没有免疫原性，需与载体蛋白结合才能成为完全抗原（免疫原）。杨艳艳等[11]利用琥珀酰酐改造CAP 为半抗原（Hap⁃ten）CAP 半琥珀酸酯(CAP-HS)，以混合酸酐法（Mixed anhydride method，MA）将半抗原与载体蛋白偶联获得免疫原CAP-HS-BSA，免疫BALB/c 小鼠后，采用细胞融合技术得到抗CAP 单克隆抗体（CAP mAb），效价和半数抑制浓度（Half maximal in⁃hibitory concentration，IC50）分别为1.28×105、7.54 ng/mL；张红星等[12]采用重氮化法合成抗原，免疫大白兔后，所得抗体的效价和IC50分别为8.1×103、9.0 ng/mL；罗舜菁等[13]运用对氯甲基苯甲酸（CBA）、对氯甲基苯甲酸甲酯（MCB）分别对CAP 进行改造，再用MA 法将半抗原与载体蛋白合成为免疫原、检测原，结果显示，后者的灵敏度优于前者；陆蕾等[14]运用重氮化法得到的抗体的效价为1.28×105，优化建立的间接竞争ELISA（Indirect competitive ELISA,ic-ELI⁃SA）方法，其IC50为0.26µg/mL。杨伟群等[15]利用重氮法合成CAP免疫原（CAP-BSA），免疫家兔后获得抗CAP 多克隆抗体（CAP polyclonal antibody, CAP pAb），经ELISA 鉴定该抗血清具有良好的特异性，IC50值为13.65 ng/ml，检测限（limit of detection，LOD）为1.01μg/L。李昊、李佳仪等[16-17]用重氮化法合成抗原，免疫小鼠后，所获得抗体效价分别为2.187×105、1.28×105，前者抗体的竞争性为20.48%。

2.2 酶联免疫吸附法

ELISA 用酶标记Ag 或Ab，适用于医学实验室、体外诊断产品制造商、监管机构、外部质量评估和能力测试机构，主要类型包括间接法、双抗夹心法、竞争法，分别用于测定Ab、大分子Ag 和小分子Ag，竞争法特别适用于食品安全分析，该法又可分为直接竞争ELISA（Direct competition ELISA,dc-ELISA）和ic-ELISA。

1）直接竞争ELISA 法。张立辰等[18]以CAP mAb为基础，建立了dc-ELISA，该方法IC50为0.54 ng/m L，LOD 为0.10 ng/mL，将该法用于测定鳕鱼和虾样品中CAP的残留，加标回收率为62.6%～120.0%，CV范围为0.94%～13.52%。刘姚等[19]以CAP mAb为基础，建立了蜂蜜中CAPdc-ELISA 检测法，对其6个影响因素进一步优化，蜂蜜样品的LOD 和定量限（Quan⁃tification Limit，LOQ）分别为0.15 ng/g 和0.33 ng/g，加标回收率为97.58%～100.94%，批内、批间CV 均小于11.0%。张连彦等[20]为了检测动物源性食品中CAP 的非法添加，在优化了反应条件和前处理方法的基础上，建立了dc-ELISA法，其LOD为1.0 mg/kg，添加回收率为81.0%～112.0%，批内和批间变异系数（Coefficient of variation，CV）均小于10.0%。

2）间接竞争ELISA 法。ic-ELISA 的检测原理主要是利用样品中游离的待测物、ELISA 板的孔底部已包被待测物与已标记的抗体发生竞争。胡拥明等[21]利用碳二亚胺法（EDC）和MA 法制备了CAP的完全抗原和检测原，免疫新西兰大耳白兔后得到pAb，以此抗体为基础建立检测CAP 残留的ic-ELI⁃SA，改法的IC50值为7.275 ng/ml，与其他结构类似物的交叉反应率（Cross reaction rate,CR）均小于0.1%。齐宁利等[22]利用试剂盒检测了鱼、虾水产品中CAP的残留，该法的精密度为1.28%，LOD 为6.25 ng/kg，添加回收率为83.67%～87.06%。杜兵耀等[23]检测了CAP ELISA 可视化微阵列芯片检测试剂盒的特性，结果显示该试剂盒在检测范围内，其线性回归具有良好的相关性，且与结构类似物的CR 均小于1.0%，批间CV 小于20.0%，牛奶样品中的平均回收率为108.5%，LOD为0.067μg/L。Doan[24]从Afyonkarahisar的14 个不同销售点收集了总共82 尾鱼样本，使用ELISA 方法分析样品中的CAP。结果显示，高达18.3%的样品被CAP 污染，在阳性鱼肉样品中，CAP残留浓度范围为0.54～10.6 ng/kg，阳性样品中的CAP 残留平均含量为4.25±2.78 ng/kg。CAP 是禁止在水产养殖中使用的抗生素，但鱼肉样品中可检测到的CAP残留表明该抗生素的非法使用。

2.3 化学发光免疫分析法

化学发光免疫分析法（Chemiluminescence im⁃munoassay，CLIA）的灵敏度和特异性优于传统的ELISA，也可用于大规模样品的筛选。萨仁托雅等[25]用CLEIA 法检测水产品中CAP 的残留，其LOD为0.016 ng/g，线性范围为0.025～6.400 ng/g，批内CV在5.5%～11.3%之间，批间CV 在12.3%～20.9%之间。任帅等[26]将免疫原CAP-HS-BSA 免疫新西兰大白兔，得到CAP pAb，以此为基础建立了检测实际牛奶样品中CAP 残留的基于iPDMS 膜的化学发光芯片免疫检测法，该法的IC50为263.0 ng/mL，线性范围为1～5000 ng/mL，LOD 为1 ng/mL，牛奶中CAP的添加回收率为77.0%～100.5%，RSD＜15%。

2.4 侧流免疫检测法

侧流免疫检测法是在mAb、免疫层析技术和标记技术的基础上发展起来的快速检测方法。大多数以胶体金、荧光素或荧光微球标记Ab，基于Ag、Ab的特异性结合。该法将胶体金标记的Ab交联到试纸条的结合垫，在试纸条硝酸纤维素膜（NC）上喷涂有显示结果的测试线（test line, T line）及控制线（control line,C line），样品中抗原与抗体结合后，胶体金可使该区域显示一定的颜色，通过与控制线颜色的对比实现快速检测。

Bai等[27]首次制备了一种新的荧光免疫色谱条，用于检测鸡肌肉中的CAP 残留。应用CAP-BSA 结合物，抗CAP 的PAb、mAb 构成荧光免疫层析条。通过电荷耦合装置扫描仪检测荧光强度，并将其转换为数字值。CAP 线性工作范围为0.1～20 ng/mL，在10 min 内LOD 为0.1 ng/mL。将该试剂盒的性能与市售ELISA试剂盒进行了比较，相关系数为0.99，表明该新型试剂盒具有良好的CAP 定量能力。Zhou 等[28]开发了一种胶体金免疫色谱分析法（GI⁃CA），用于快速检测水产品中的CAP残留。NC膜被用作载体，CAP pAb 被用作标记蛋白，制备的胶体金纳米颗粒（colloidal gold nanoparticles，AuNPs）的平均直径约为20 nm，胶体金溶液的最佳pH 值和CAP 抗体的量分别为8.0 和7.2μg/mL，纯化后将CAP 抗体固定在结合垫上，将CAP 偶联物和山羊抗兔IgG 包被在NC 膜上，用1% BSA 封闭非特异性位点，标准溶液中CAP的最低可检测浓度为0.5 ng/mL，具有良好的重现性。对于在背肌中注射单剂量CAP 的鲫鱼的真实样品，CAP 残留物的最低可检测浓度为0.5μg/kg，色谱分析时间少于10 min，并且该条在不同温度下具有90 d 以上的长存储寿命，该试纸条提供了一种快速检测水产品中CAP 残留的方法。

丁乔棋等[29]利用羧基化CdTe/ZnSe 量子点荧光微球标记CAP mAb 获得荧光探针，将CAP 免疫原（CAP-HS-BSA）、羊抗鼠二抗（Goat anti-mouse HRP-labeled immunoglobulin，GaMIg-HRP）分别喷涂NC 膜上，并保持一定距离，形成T 线、C 线，完成CAP 试纸条的装配。用该试纸条测定牛奶样品中CAP 的残留，用时不超过15 min，线性范围在0.1～100.0 ng/mL 之间，LOD 值为0.1μg/L。牛奶样品CAP 的添加回收率在93.3%～97.9%之间，相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）为4.9%～6.9%。刘广源等[30]制备了牛奶中抗菌素的快速检测试纸，并对其各个反应条件进一步优化，利用该试纸检测了市售散装及袋装牛奶中CAP 的残留，其测定结果与国标法基本相同。崔乃元等[31]用羧基化铕微球标记CAP mAb，CAP 抗原及GaMIg-HRP 分别包被于NC膜上作为T线和C线；用所建立的时间分辨荧光免疫层析法检测水产品（鱼、虾、蟹）中CAP的残留，LOQ 为0.1μg/kg，添加回收率为73.5%～114.2%，CV 为3.9%～11.5%，满足了水产品中CAP残留测定的要求。汤轶伟等[32]将GSH-Mn-ZnS QD与CAP mAb 偶联制备荧光探针并对其各个组件的包被量进行了优化，制备出CAP 荧光免疫层析试纸条，优化后该试纸条的LOD 可达100 ng/mL，该试纸条灵敏度高、特异性好、可应用于鳗鱼样品中CAP的残留测定。

3 核酸适配体技术

免疫分析检测法虽然具有操作简便、检测时间短、成本低等优点，但其所用的核心材料为Ab，Ab易受温度、时间、pH 等外界环境的制约而出现变性[33]。鉴于此，探寻新的动物源性食品中CAP 高效检测方法势在必行。核酸适配体（Aptamer，Apt）又被称为“化学抗体”，是通过指数富集配体系统进化技术（System antievolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）从随机序列文库中分离得到的一段DNA 或RNA序列，Apt能识别对应的靶标并与之特异性结合，与常用的Ab 相比具有性质稳定，特异性、灵敏性均强等优点，成为分子生物学、分析化学、医学等领域关注热点之一。

吴彩叶等[34]将Fe3O4磁珠标记CAP 适配体（CAP Apt）获得捕获探针，用MOF（Fe-MOF）标记该Apt的互补链到作为纳米示踪剂（MOF-cDNA），将两者偶联后可得到铁磁性仿生复合探针，完成了仿生比色传感器的构建，改法的检测范围为0.01～10 ng/mL，LOD 为0.3 pg/mL（S/N=3），实际样品的加标回收率为86.9%～93.5%。高慧菊等[35]构建了基于Apt-聚合酶螯合物-氧化钯纳米颗粒（Apt-En Vision-PdO, cD⁃NA-EV-PdO）复合物进行双重信号放大的比色Apt传感器方法来测定CAP的残留，该方法检测范围为0.02～150 ng/mL，LOD 为0.01 ng/m L，用该方法检测了鱼肉和鹅肉中的CAP 的残留，其结果与ELISA 法相同。Duan 等[36]基于CAP 特异性适体和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）设计了一种新颖的CAP 检测灵敏方法：首先将CAP Apt 与生物素修饰的互补探针杂交，然后通过生物素固定在链霉抗生物素蛋白缀合的磁珠上。当添加CAP 时，Apt 将通过形成发夹结构而与CAP 特异性结合，并从磁珠中释放出来以通过qRT-PCR 进行CAP 检测。优化了影响该基于适体的检测系统的测定精度的因素（即探针链长度，适体浓度，NaCl浓度和孵育时间）。在最佳条件下，该检测系统对CAP 表现出高灵敏度，LOD 为0.1ng/ mL（线性范围为0.1～20 ng/mL）。该检测系统用于检测实际加标牛奶中的CAP，加标牛奶样品中CAP的回收率为94.0%～102.0%。

4 结语

动物源性食品中CAP 残留带来的食品安全问题引起了公众的广泛关注，氯霉素的检测技术在不断的发展。目前，色谱分析可以作为确证检测，相对成熟的免疫分析技术，如ELISA、胶体金试纸条等可以用于大规模检测样品的筛选，综合利用上述两类检测方法是当前切实可行的措施。针对这两类方法的缺陷，开发出新型的检测方法势在必行，如基于核酸适配体建立的免疫分析技术、生物传感器等，以便更好地为食品安全保驾护航。