肿瘤相关蛋白分子核转运机制研究进展

张艺新，戴蓓英，杨勇，陈真

(1.中国药科大学药学院，江苏 南京 211198；2.中国药科大学药物科学研究院，江苏 南京 211198；3.中国药科大学基础医学与临床药学学院，江苏 南京 211198)

细胞的生命活动基于错综复杂的信号传导，其中多种信号分子的传导依赖于正常运转的核转运系统(nuclear transport system，NTS)，如转录因子入核调控下游靶基因的表达以及靶基因产物出核发挥功能等。研究表明，核转运异常会导致某些信号通路的持续激活或抑制，进而导致包括肿瘤在内的多种疾病的发生。肿瘤的发生和发展常与多种信号蛋白异常的亚细胞定位相关，阐明信号蛋白的核转运机制对于研究肿瘤发生发展过程至关重要。

1 核转运系统的组成以及核转运机制

核转运系统主要由核孔复合体(nuclear pore complex，NPC)和核转运受体(nuclear transport receptors，NTR)组成，可允许分子量大于40 kDa的大分子物质进行选择性的核-质交换。NPC是镶嵌在核膜上的一种运输通道，由30多种核孔蛋白(nucleoporins，NUP)分别构成胞质纤丝、胞质环、核质环、核篮等NPC亚结构[1]。约三分之一的NUPs都含有苯丙氨酸-甘氨酸(phenylalanine-glycine，FG)重复域，该结构域可延伸至核孔的中央通道，用于构建选择性相关的网状结构[1-2]。NTR主要由核蛋白-β(karyopherin-β)超家族组成，其中10个参与核输入如importins，7个参与核输出如exportins，2个参与双向转运，以及1个尚未鉴定的蛋白[3-4]。

通常，importin-α可识别货物蛋白的核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)并与之结合，然后与importin-β结合形成“NLS/importin-α/importin-β”三聚体[5]。此外，importin-β也可直接与NLS序列结合，而不依赖于importin-α。在这两种情况下，importins和货物蛋白复合体均可与NUP的FG重复域结合并通过NPC进入核内，然后与Ran-GTP[Ran(ras-related nuclear protein)in complex with GTP]结合，从而使货物蛋白与importins解离，随后importins可与Ran结合，通过其特定的核输出受体exportin-2重新穿梭至胞质内[6]，以进行下一次的核转运。值得注意的是，有些蛋白可直接与NUP结合并转运至核内，而不依赖于NTR，如β-catenin、SMADs等[7]。在出核转运过程中，货物蛋白可通过其核输出序列(nuclear export sequence，NES)与exportins和Ran-GTP在核内形成三聚体，通过扩散作用出核。到达胞质后，GTP被水解成GDP，货物蛋白被释放至胞质内[5,8]。

2 肿瘤相关信号分子的核转运机制

2.1 p53信号通路 p53是一种肿瘤抑制蛋白，可通过调控细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复等避免癌变的发生，因此其被称为“基因组守护者”。临床上约50%的肿瘤患者都存在p53的突变[9]。p53中NLS的泛素化可阻碍其与importin-α3结合，并抑制其向核内转运，滞留在胞质内的p53可被蛋白酶体降解，使得p53维持在较低的表达水平。在DNA损伤、癌基因异常激活等应激条件下，p53泛素化水平降低，从而导致其NLS与importin-α3结合[10]，促进p53向核内转运，入核的p53可形成四聚体，使其NES被包裹在内，并导致其不能与exportin-1结合而被滞留在核内[11]，从而持续激活下游信号通路。综上，早期importin-α3介导的p53主动转运增强以及后期exportin-1介导的p53核输出受阻均与DNA损伤、癌基因异常激活等应激反应相关[12]。此外p53/MDM2调节因子RYBP的亚细胞定位对于p53功能的发挥十分重要[13]。Tan等[13]的研究表明，野生型RYBP主要定位于核内，将其NLS进行突变后，RYBP则主要定位于胞质内。胞质定位的RYBP突变体可显著抑制MDM2介导的p53泛素化，从而抑制p53的降解并促使其向核内转运。因此，相比于野生型RYBP，定位于胞质的RYBP突变体可显著抑制细胞增殖并诱导其凋亡，这将为临床肿瘤的治疗提供新的思路[13]。

核转运复合体除了可以介导p53的核转运之外，还参与调控p53靶基因的表达，但这种功能不依赖于核转运过程。例如exportin-2可以与p53靶基因(如TP53-AIP)的启动子结合，从而诱导其表达[14]。此外，靶向RNAi筛选结果显示，NUP98可通过与p21[15](CDKN1A，p53下游的细胞周期调控因子[16])mRNA的3′UTR区结合，从而在转录后水平调节p21的表达，避免p21被外泌体降解。p21在肿瘤生物学方面具有复杂的作用，既可抑制肿瘤的生长，但是在p53缺失的情况下又能促进肿瘤细胞的增殖。其复杂的生物学功能与多种决定因素相关，其中就包括p21的亚细胞定位[17-18]。作为p53的下游靶基因，核内的p21通过其对细胞周期的调控作用抑制肿瘤细胞的增殖[17-19]，但是胞质内的p21可通过抑制pro-caspase 3、caspase 8,以及caspase 10发挥抗凋亡作用，因此胞质内的p21具有致癌性并可导致较差的预后[17-19]。Exportin-1可介导p21的核输出[20]，因此exportin-1的过表达可促进p21在胞质中的积累，从而发挥其促癌作用。

2.2 WNT/β-catenin信号通路CTNNB1外显子3的错义突变常会导致WNT级联信号的异常激活。在这一过程中，β-catenin在核内积聚，并与淋巴增强因子(LEF)/T细胞因子(TCF)相互作用，驱动MYC、CCND1等促癌基因的表达[21-22]，从而促进肝癌的发生。由于β-catenin不含有NLS，因此其核转运不依赖于NTR和Ran-GTP[7]，而是通过直接与NUP62、NUP98、NUP153、NUP358结合并向核内转运[23]。截短体实验表明，β-catenin通过其C端以及ARM重复序列(Armadillo repeats)与NUP结合被转运至核内[24]，同样该区域可与Ran-BP3结合介导β-catenin的出核转运[24-25]。尽管Ran-BP3是exportin-1的辅助因子，但是β-catenin的核输出并不依赖于exportin-1[25]。综上所述，β-catenin的入核和出核转运均不依赖于NTR。

2.3 NF-κB信号通路 NF-κB信号通路在炎症和免疫反应中发挥重要作用，并且与炎症相关型肿瘤的发生和发展密切相关。NF-κB作为转录因子可激活下游靶基因从而调控细胞增殖、凋亡、分化、应激和免疫应答等细胞活动[26]。NF-κB是由p50、p52、p65(RELA)、c-REL、RELB 5种亚基两两组合形成的二聚体，多数情况下是由p50和p65组成异二聚体[26]。IκBs(如IκBα、IκBβ)是NF-κB的抑制剂，其通过与NF-κB结合从而阻碍NF-κB的NLS序列与NTR结合，从而将NF-κB阻滞在胞质内[27]。当细胞受胞外信号刺激后，IκB激酶复合体使IκB磷酸化，随后导致其泛素化并被蛋白酶体降解，从而暴露NF-κB的NLS，随后NF-κB可迅速被转运至核内，诱导相关基因的表达[27]。

TNF-α可诱导NF-κB(p50/p65)向核内转运[27]，该转运过程由importin-α3以及importin-α4介导。此外，NF-κB亚基与importin-α的结合具有特异性，如p52可直接与importin-α3、importin-α4、importin-α5、importin-α6结合；c-REL可与importin-α5、importin-α6、importin-α7结合；RELB可与importin-α5、importin-α6结合[27]。值得注意的是，NF-κB二聚体与importin-α结合的特异性仅取决于其中一个亚基，如RELB介导p52/RELB二聚体与importin-α的结合，p52则介导p52/p65二聚体与importin-α的结合[28]。NF-κB不仅可与NTR结合，同时还可与NUP88相互作用。过表达的NUP88可抑制NF-κB的核输出，从而导致其在核内积聚[29-31]。

2.4 Ras/MAPK和PI3K/AKT信号通路 受体酪氨酸激酶(RTK)如胰岛素样生长因子受体(IGF-R1)，可通过Ras/Raf/MEK/ERK信号通路促进细胞增殖和存活，亦可通过PI3K/AKT信号通路促进蛋白质的合成以及葡萄糖代谢，最终发挥促肿瘤作用[32]。细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的亚细胞定位对于Ras/Raf/MEK/ERK激酶级联反应至关重要。在生理条件下，MEK1/2可将ERK1/2锚定在细胞质中[33]。当接受外界刺激后，MEK1/2对于ERK1/2的磷酸化修饰导致其构象发生改变并与MEK1/2亚基分离，随后importin-7识别ERK1/2激酶插入区中磷酸化的SPS(Ser-Pro-Ser)基序[34]，从而将ERK1/2转运至核内而不依赖于importin-α。也有研究证明ERK2可通过NTR依赖的方式入核[35-36]，其核输出依赖于exportin-1[37]。胞质内Ca2+浓度也可影响ERK2的亚细胞定位，高浓度的Ca2+可增加ERK2与NUP153的结合，使ERK2滞留在核膜上从而抑制其向核内转运[38]。

在PI3K/AKT信号通路中，磷酸化的AKT可抑制TSC1和TSC2，从而激活mTORC1。激活的mTORC1对真核细胞翻译起始因子(eIF4E)结合蛋白(4E-BPs)进行磷酸化修饰，使其与eIF4E分离。游离的eIF4E可使NPC胞质侧的成分发生重排，从而促进eIF4E下游靶基因mRNA(如CyclinD1、c-MYC、MDM2)向胞质内转运并翻译成蛋白质[39-40]。有研究表明，在上述过程中，eIF4E可促进Ran-BP1以及DDX19的表达，抑制NUP358/Ran-BP2表达，并能使NUP214重新定位。相反，NUP358/Ran-BP2过表达可抑制eIF4E靶基因mRna的核输出，从而阻止肿瘤恶化[40]。

2.5 JAK/STAT信号通路 JAK/STAT信号通路可介导多种细胞因子，如表皮生长因子(EGF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)、干扰素(INF)等的信号传导，从而参与调节细胞增殖、分化、免疫等重要的生物学过程。JAK/STAT信号通路在多种血液瘤和实体瘤中均处于持续激活状态[41]。当上述细胞因子与胞膜上相应的受体结合时，后者形成二聚体，从而激活胞内的酪氨酸激酶(JAK)。活化的JAK可使转录因子STAT磷酸化并形成二聚体，随后被转运至核内，从而调节下游靶基因的表达。

STAT1和STAT3可以较高的亲和力直接与importin-α5结合[42]，同时STAT3与importin-α7也存在较弱的相互作用，而STAT5a以及STAT5b则不与importin-α结合[43]。Riku等[42]的研究表明，STAT1与importin-α5的结合依赖于STAT1 DNA结合域中410～413位的氨基酸。STAT3与importin-α5的结合则依赖于STAT3中214和215位的精氨酸，其414和417位的精氨酸虽不直接参与STAT3与importin-α5的结合，但对于维持STAT3二聚体的构象至关重要[43]。

在出核转运方面，STAT1中400～409位氨基酸，以及其卷曲螺旋结构域中302～314位的氨基酸均可充当NES与exportin-1结合，从而促进STAT1向胞质内转运[42,44]。值得注意的是STAT1 400～409位的NES与其410～413位的NLS相邻，因此STAT1中NES的突变不仅能影响其与exportin-1的结合，同时也可能干扰其NLS与importin-α5的相互结合[42]。

2.6 TGF-β信号通路 TGF-β超家族配体与TGF-β受体Ⅱ结合，后者可催化Ⅰ型受体的丝氨酸残基磷酸化并使其活化，活化的Ⅰ型受体可使SMAD蛋白磷酸化并转运至核内，从而与核内的其他辅因子一起调节靶基因的转录[45]。由于TGF-β信号通路通常会抑制细胞的生长，因此该通路的失活可促进肿瘤的发生和发展[45]。此外，TGF-β受体和SMAD蛋白的突变在肿瘤中均有报道[45]。

TGF-β诱导的SMAD2、3磷酸化可降低其与SARA(定位于细胞质的SMAD保留因子)的结合，从而促使其向核内转运[46]，但是SMAD2、3的入核转运并不依赖于该磷酸化过程[46]。SMAD2、3的MH2结构域含有3个疏水口袋，该疏水口袋可与CAN/NUP214、NUP153的FG重复域结合，从而促进SMAD2、3的入核转运[46]。虽然SMAD2的核转运不依赖于NTR，但是importin-β可通过与CAN/Nup214的竞争性结合抑制SMAD2向核内转运[47]。磷酸酶PPM1A可将p-SMAD2、3去磷酸化，以促进RanBP3与SMAD2、3的结合，从而促进SMAD2、3的出核转运[48]。

SMAD蛋白家族包括R-SMAD、Co-SMA、I-SMAD 3个亚家族，分别为SMAD1-9[49]。与SMAD2、3相似，SMAD4的入核转运同样不依赖于NTR，是由CAN/NUP214以及NUP153介导的，但是该过程不受SARA的影响[46]。SMAD4的出核转运依赖于exportin-1。磷酸化的SMAD2、3或其他转录辅助因子可通过与SMAD4结合，从而干扰SMAD4与exportin-1的相互作用，导致SMAD4在细胞核中积聚[46]。

2.7 人端粒酶催化亚基(hTERT) 端粒是真核染色体末端的核蛋白复合物，对于维持染色体的完整性至关重要。高度保守的端粒DNA在每次复制后都会缩短，当端粒缩短至一定程度，细胞则停止分裂。因此，端粒的长短和稳定性决定了细胞的寿命，并与细胞的衰老和癌变密切相关[50]。染色体末端端粒重复序列的从头合成需要端粒酶的催化，该酶在成人体细胞中不表达，但肿瘤细胞可通过激活端粒酶的表达来躲避“端粒危机”，从而获得永生化。

肿瘤细胞内端粒酶的活化依赖于人端粒酶催化亚基(hTERT)的入核转运。有研究表明，在hTERT的222～224位以及236～240位的氨基酸可作为其NLS，同时，这两个NLS之间的227位丝氨酸的磷酸化对于hTERT的入核转运也是必需的[51]。NLS的磷酸化可导致hTERT构象改变并暴露其NLS[51-52]，后者可与importin-α1、3、5以及importin-β结合，并以Ran依赖的方式将hTERT转运至核内[51]。其次，hTERT磷酸化导致的构象转换也可能暴露其与其他因子结合的位点，例如，AKT激酶对hTERT的磷酸化可促进hTERT与NF-κB p65亚基的结合，二者结合后可迅速转移至核内，从而激活端粒酶并使端粒得到延长[53]。

hTERT 970-981位的NES通过与exportin-1结合从而将hTERT转运至胞质内[54]。有研究表明，14-3-3蛋白可通过其C端与hTERT的C端结合，抑制hTERT的NES与exportin-1的结合，从而抑制hTERT向核外转运[54]。

2.8 JNK/c-Jun信号通路 JNK可被多种细胞因子(如肿瘤坏死因子α、白介素-1、表皮生长因子)、应激条件(如氧化损伤，电离辐射)等多种因素激活并转运至核内，核内的JNK可调节包括c-Jun在内的多种转录因子的活性，转录因子c-Jun可通过激活其下游靶基因从而调控肿瘤的发生和发展[55]。在肿瘤中，异常激活的c-Jun可使PI3K、ERK介导的增殖相关通路持续活化[56]，并可使p53、Bcl-2介导的凋亡通路受阻，从而加速肿瘤的生长。在此过程中，c-Jun的活化依赖于其在细胞核中的定位，因此c-Jun在细胞核中的异常积累是导致肿瘤发生和发展的重要因素。

c-Jun有两种入核方式。首先，它可通过其273～276位的NLS与多种NTR(如importin-5、importin-7、importin-8、importin-9、importin-13、importin-β和transportin)结合，并以Ran依赖的方式转运至核内，这使得c-Jun的核转运不依赖于某种特定的NTR，从而确保其能稳定地转运至核内发挥作用[57]。但是importin-α会抑制c-Jun向核内转运[58]。值得注意的是，在NLS中，273和275位氨基酸的突变会显著降低c-Jun与importin-5、importin-9、importin-13以及importin-β的结合，而几乎不影响其与importin-7或transportin的结合[58]。其次，c-Jun可通过“搭载”机制转运至核内。c-Jun可与其他含有碱性亮氨酸拉链的内源性蛋白(如 c-Fos)形成异源二聚体，然后通过这些蛋白的NLS与importins结合，从而转运至核内[57-58]。这些异二聚体在通过NPC时可能需要多种转运蛋白的参与[73]。

有研究表明，c-Jun的入核不依赖于JNK介导的磷酸化以及二者的相互作用[57]。但是，c-Jun与JNK的结合可促进JNK向核内转运[57]。c-Jun在核内的积累不依赖于其DNA结合能力，其核输出也不依赖于exportin-1[57]。

3 总结与展望

以往对肿瘤发生发展的机制研究，大多集中在信号蛋白的异常表达或基因的异常转录上，而较少关注蛋白在亚细胞定位方面的差异。本文着重介绍了8种经典的肿瘤相关蛋白的核转运机制，这将有助于了解肿瘤发生和发展的机制，并对肿瘤治疗及预后评估至关重要。未来需要进一步的研究来阐明核转运蛋白作为诊断、预后标志物，以及临床治疗靶标的潜力。