乳腺癌急性放射性皮炎中自噬相关基因Beclin1的表达及临床意义

杨 丹，刘梦瑶，陈 勇

（南华大学附属邵阳医院血液肿瘤科，湖南 邵阳 422000）

据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的最新数据显示，2020年女性乳腺癌发病率已一跃成为全球首位。放疗（放射治疗）在减少乳腺癌复发的同时也为提高患者的生存率做了一定的贡献。急性放射性皮炎是放疗开始后90 天以内出现的皮肤黏膜的炎症性损伤，可表现为红斑、脱皮、出血、溃疡或局部坏死等。目前对于放射性皮炎的评判标准主要有三种，临床上最常用的评判标准是RTOG 标准[1-2]。在RTOG 标准中，急性放射性皮炎可分为5 级，0 级为皮肤无反应组，1-2级为轻度放射性皮炎组（轻度皮炎组）,3-4 级为重度放射性皮炎组（重度皮炎组）。

Beclin1 基因是首个被鉴定的哺乳动物自噬相关基因，细胞内的自噬活动在正常条件下处于较低水平，然而在细胞因子、缺氧等的作用下可迅速增强。研究表明，自噬能够通过抑制细胞凋亡、抗细胞氧化等来参与皮肤挫伤、光损伤及烧伤等的活动进展。相关研究表明，急性放射性皮炎的机制研究主要与炎症反应、胶原蛋白的变化、活性氧的产生、DNA 的损伤等有关[3]，而皮肤挫伤、光损伤及烧伤等的病理生理过程与放射性皮炎有着许多相似之处。因此，本文通过研究乳腺癌接受放射治疗的患者皮肤组织中Beclin1 蛋白的表达情况，分析其与急性放射性皮炎的关系，初步探讨Beclin1 基因在放射性皮炎中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1月1日至2021年06月10日在邵阳市中心医院乳甲外科收治和病理科存档的73 例需进行放疗的乳腺癌患者皮肤组织蜡块及患者临床资料，其中皮肤无反应组21 例，轻度皮炎组30 例，重度皮炎组22 例。各组年龄，体重等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），如表1。

1.2 检测方法

免疫组化（酶标记聚合物技术）所有乳腺癌皮肤组织取4μm 厚度切片，经固定、脱水、包埋、脱蜡后，用柠檬酸钠缓冲液修复法进行抗原修复，然后加入辣根过氧化物酶阻断试剂来抑制内源性过氧化物酶，后滴加一抗Beclin1（兔抗人单克隆抗体，长沙维世尔生物科技有限公司，按照1：300 稀释），生物素来标记二抗，PBS

(磷酸盐缓冲液)反复冲洗后，最后滴加DAB 显色剂，苏木素复染色，1%盐酸水溶液分化，不饱和碳酸锂返蓝，脱水，透明，干燥，封片，显微镜下读片。用PBS 代替一抗来作阴性对照。既往研究表明，Beclin1 表达于细胞胞浆中。

1.3 结果判断

使用免疫积分判断标准记录染色强度：未着色:0 分，淡黄色:1 分，黄色:2 分，棕褐色:3 分。从整个切片中任选5 个高密度视野（×100）进行评分，每个视野计数100 个细胞。按照染色比例计分≤10%:1 分，10%<染色比例计数≤50%:2 分，＞50%:2 分。由两位病理科专家在对临床资料不知情的前提下进使用半定量积分法进行判断。半定量积分法是指染色强度与染色比例的相乘积分，半定量积分≤3:阴性，＞3 分:阳性。

1.4 统计学方法

SPSS26.00 软件，计数资料采用百分百(%)表示，乳腺癌患者皮肤组织中Beclin1 蛋白的表达率使用卡方检验，P<0.05 有统计学意义，P<0.01 有显著差异。

2 结果

2.1 Beclin1 在放射性皮炎组织中的表达

如表1及图1所示，Beclin1 在皮肤基底细胞胞浆中表达，皮肤无反应组中Beclin1 蛋白阳性表达率为76.19%，轻度皮炎组中Beclin1 蛋白阳性表达率为46.67%，重度皮炎组中Beclin1 蛋白阳性表达率为13.64%，三组对比差异有统计学意义（P<0.05），表明在放射性皮炎的三个组别中的Beclin1蛋白阳性表达有可比性。

2.2 Beclin1 的表达与急性放射性皮炎的关系

将皮肤无反应组、轻度皮炎组及重度皮炎组中Beclin1的表达率进行两两对比，如表1所示，皮肤无反应组中Beclin1 的表达率明显高于轻度皮炎组，差异有统计学意义（P<0.05）；皮肤无反应组中Beclin1 的表达率明显高于重度皮炎组，有显著性差异（P<0.01）；轻度皮炎组中Beclin1 的表达率明显高于重度皮炎组，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

据国家癌症中心统计报道，中国女性乳腺癌每年发病率居女性恶性肿瘤首位，死亡率居女性恶性肿瘤第四位[4]。放疗联合其他治疗手段，能降低局部区域的复发率、肿瘤远处转移风险等，最终影响总死亡率。

自噬借助溶酶体降解大分子物质，回收利用基本构件，进行物质周转，参与维持内环境的稳态[5]。自噬泡后成核并延长，募招受损大分子物质形成自噬体，并与溶酶体结合成自噬溶酶体[6]。Beclin1 是自噬关键调控分子，其编码的Beclin1蛋白编码约450 个氨基酸，包含进化保守结构域（ECD)、Bcl-2 同源－3(BH3）结构域、中央卷曲螺旋结构域(CCD）三个结构域。通过与III 类磷酸肌苷－3－激酶VPS34 结合参与募集蛋白质，诱导自噬的启动。同时介导其他自噬蛋白的定位及上下游蛋白的调控，进而调控自噬体的形成及成熟[5]。

在大鼠皮肤挫伤的研究中发现，皮肤损伤后随着时间的延长，细胞自噬增加，提示细胞自噬可能参与了皮肤损伤后修复、愈合过程[7]。研究证实miR-506-3p 在烧伤组织的真皮成纤维细胞中显著下调，检测表明Beclin1 是miR-506-3p 的直接靶点，引入Beclin1 可拮抗miR-506-3p 过表达对成纤维细胞增殖、自噬和分子间表达的抑制作用[8]。

当皮肤受到放射性刺激时，活性氧的产生增加或清除下降，其不断积累造成皮肤基底细胞增殖分化及基底层向角质层迁移过程受限。细胞能够产生抗过氧化物质阻断活性氧对皮肤组织氧化损伤，维持氧化反应的平衡。研究发现放射线能氧化脂质，导致细胞膜及线粒体膜受损，引发细胞中水分丢失，毛细血管扩张，皮肤出现红斑、肿胀等损害，同时活性氧能促使DNA 结构及功能紊乱及其不程度的丢失，生成大量核酸内切酶胸腺嘧啶乙二醇和间接反应DNA 损伤的8－羟基鸟嘌呤。自噬能及时清除氧化受损的细胞器，提高细胞存活率[9]。有关研究表明，神经生长因子缺乏时，活性氧不断蓄积，当敲除Beclin1 与Atg 7 后，活性氧蓄积增加，自噬参与了减少神经细胞活性氧蓄积进展活动[10]。本研究中，Beclin1 在皮肤基底细胞胞浆中表达，Beclin1 蛋白在细胞胞浆中的定位与其自噬功能相关，考虑Beclin1 参与的自噬可能在急性放射性皮炎中发挥作用。在皮肤无反应组中Beclin1 的表达率明显高于轻度皮炎组，差异有统计学意义（P<0.05）；皮肤无反应组中Beclin1 的表达率明显高于重度皮炎组，有显著性差异（P<0.01）；轻度皮炎组中Beclin1 的表达率明显高于重度皮炎组，差异有统计学意义（P<0.05），在轻度皮炎组中Beclin1 参与自噬活动显著增加，可能是早期干预了氧化应激活动，从而参与减轻炎症的发展活动。

在自噬光损伤研究中，敲除自噬相关基因beclin1、Atg5后，皮肤组织对于紫外线照射诱导的细胞凋亡更为敏感，提示自噬具有抑制细胞凋亡并提高细胞的存活率的作用[11]。细胞凋亡是机体受刺激后及时清除多余及受损细胞的程序性过程，参与机体的细胞更新。放射线可引起Bcl-2 及Ras 等凋亡抑制基因的低表达，凋亡诱导基因的过表达，引发细胞凋亡。抑制Bcl-2 可引起线粒体膜肿胀，释放出活性物质细胞色素C，其和半胱氨酸蛋白酶9 形成凋亡体，引起半胱氨酸蛋白酶9 自我活化与剪切，裂解活化半胱氨酸蛋白酶3 来切割底物，导致蛋白级联切割放大，最终引起细胞凋亡[12]。Beclin1 基因的BH3 结构介导与Bcl-2/Bcl-XL 的相互作用，形成的复合体对于自噬活动有负反馈调节作用。半胱氨酸酶1 是一种具有多种功能的高迁移率基群核蛋白B1，半胱氨酸酶1 在活性氧的诱导下容易被氧化，氧化的半胱氨酸酶1 抑制beclin1 与Bcl-2 的相互作用，以促进自噬的过程，从而及时清除受损细胞器保护细胞[13]。

综上，Beclin1 可能通过通过清除活性氧及抑制细胞凋亡等参与了皮肤损伤组织的修复,从而及时干预急性放射性皮炎的进展。早期干预Beclin1 阴性的乳腺癌需放疗的患者，可能对治疗放射性皮炎起到一定的作用，Beclin1 有望成为急性放射性皮炎的治疗靶点，目前对于自噬对急性放射性皮炎的影响仍未得到完全阐述，自噬调节炎症性反应及细胞因子的产生的关系尚未明确，仍需要进一步的研究来阐明自噬参与急性放射性皮炎的明确机制，以期对急性放射性皮炎的预测、预防、治疗产生治疗作用。