抗生素菌渣中活性物质的提取及应用现状

钟为章，冯卫博，许 彬，宁志芳，秦 学，李再兴

(1.河北科技大学环境科学与工程学院，石家庄 050018；2.河北省污染防治生物技术实验室，石家庄 050018)

据统计，2019年中国抗生素产量达21.8万t，占全球市场总量的70%以上[1]。抗生素菌渣是抗生素经发酵液提取后所剩余的残渣，主要由剩余培养基、菌丝体、代谢中间产物和残留抗生素组成[2]。按照生产1 t抗生素生成8～10 t湿菌渣估算[3]，2019年中国抗生素菌渣生成量高达约200万t。因其中残留抗生素，如果对其处理不当，会造成严重的生态环境问题，威胁人类健康。依据《国家危险废物名录(2021年版)》，抗生素的培养基废物、中间体为危险废物，其处理处置已较大限制中国制药行业的发展。焚烧处理和安全填埋，存在着占地面积大、处置成本高和二次污染等问题，而且容易造成菌渣中大量有用有机物的浪费[4-6]。

抗生素菌渣菌丝体中含有多种可利用的活性物质，如蛋白质、壳聚糖、麦角固醇等。其中，蛋白质含量丰富，占干物质的30%～40%，麦角固醇是真菌细胞膜的重要组成部分[7]，而细胞壁上均含有壳聚糖[8]。因此，在抗生素菌渣无害化处理的前提下，其资源化利用已成为相关研究领域的重要课题。

由于抗生素菌渣含有丰富的活性物质，通过微生物发酵技术将其制成饲料及肥料，但后续发现这些产品会造成抗生素残留在动植物体内产生富集作用，从而进一步地影响人类的健康，因此许多国家都禁止将抗生素菌渣作为饲料添加剂[9]。而将抗生素菌渣中有效活性物质提取出来加以利用，可以很好地解决抗生素残留造成的不良影响。

现综述近几年运用物理、化学和生物法等方法从菌渣中提取蛋白质、壳聚糖和麦角固醇等活性物质的工艺研究进展，分析各提取工艺的优劣。最后通过结合抗生素菌渣的特性，分析从抗生素菌渣中提取活性物质的问题，并对其解决方案进行展望。

1 蛋白质

1.1 提取现状

蛋白质作为生命的物质基础，在各种生命活动中起着极其重要的作用。由于抗生素菌渣中菌丝体具有刚性细胞壁，胞内蛋白质释放困难，难以充分利用。因此，从抗生素菌渣中提取蛋白质的关键环节是实现高效水解，对其进行破壁溶胞。常用的方法包括物理、化学、生物化学和组合技术。其中，物理方法包括超声波、热、微波和高压喷射法等。化学方法包括酸热、碱热、pH调节等。生化方法包括酶处理、辅助酶处理、嗜热菌。不同的方法与其蛋白质回收效率密切相关，并且蛋白质的水解产物对蛋白质产物的后续利用具有显著影响。

物理法如微波辐射法是在微波的照射下，抗生素菌丝体吸热，细胞壁裂解，使其中的蛋白质等物质溶于液体中，优点在于反应速率快，但是前期投入较大。韩洪军等[10]采用微波辐射法处理青霉素菌渣，在菌渣含水率为90%、微波辐射功率414 W下处理120 s，达到最佳的破壁效果，蛋白质溶出浓度为265.76 μg/mL。Cai等[11]采用微波法处理头孢霉素菌渣，在含水率为92.5%、微波辐射功率300 W下处理800 s，达到最大的破壁效果，上清液中溶解性蛋白浓度达到6 332.69 mg/L，相较于初试浓度提高了28.4%。化学法是指在强酸或者强碱的作用下，使细胞壁裂解，溶出蛋白质，同时因为抗生素菌渣大多在碱性条件下易溶解，而在酸性条件下会发生等电点沉淀，所以常用碱解法，优点在于反应温度等条件限制不大，但是反应需要加入大量药品。王贺飞等[12]运用酸法处理土霉素菌渣，在菌渣含水率96%、pH1.0、反应温度120 ℃下处理4 h，蛋白质最高溶出率达到29.96%，溶出浓度达到4 784.2 mg/L。王贺飞[13]还利用碱/超声联合法处理土霉素菌渣，在菌渣含水率97%、pH13.0、声能密度7.5 W/mL下反应30 min，蛋白质溶出率为84.11%，溶出浓度达到19 710.94 mg/L。刘玲[14]运用碱法处理青霉素菌渣，在pH9.0、常温下处理60 min，此时蛋白提取率为60%；在加热环境下，温度40 ℃下处理60 min，蛋白质提取率可达到92.1%，其原因可能是温度越高，底物被活化的分子越多，越有利于反应速率的加快。生物破壁法是通过直接投加酶或者投加菌，使其在生长过程中产生酶，特定酶作用于抗生素菌丝体细胞壁上，使其断裂，胞内蛋白质溶出，孟文茹[15]用嗜热菌DF7在最佳水解温度60 ℃、最佳投加比10%(V/V)下处理头孢霉素菌渣，荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate,FDA)水解酶活性可达333.45 μgFDA/(mL·h)，为对照组的3.2倍；溶解性蛋白质浓度达到182.46 mg/L，为对照组的1.4倍。

对比物理法、化学法及联合法，生物处理技术具有低能耗、低污染、低成本、高效安全等优点，其越来越受到重视。尤其利用嗜热菌分泌的胞外酶对菌渣进行生物溶胞，更是发展前景广阔，是其资源化有效利用的新途径。

1.2 应用现状

抗生素菌渣中提取的蛋白质用途众多，可作为发泡剂原料制备泡沫蛋白灭火剂及泡沫混凝土，也可制备肥料、用作动物饲料添加剂等[16-18]。其具有较高的多肽含量，更有利于蛋白质发泡剂的制备。菌渣蛋白质泡沫灭火剂可用于扑灭易燃液体引起的火灾，但是要检验与传统的灭火器相比的灭火效果。菌渣泡沫混凝土具有良好的隔热、保温、隔音、抗冻等性质，无微生物污染和重金属超标的安全隐患，能够满足行业标准。

从菌渣中提取的蛋白质具有高含量的氨基酸，适合用于制备动物饲料。中国的蛋白质饲料严重缺乏，导致中国饲料行业过度依赖于大豆进口，严重阻碍了中国饲料业和畜牧业的发展[19]。提取抗生素菌渣中的蛋白质用于蛋白质饲料的生产具有现实意义，但因中国对于危险废物的资源化利用管理严格，没有相关的文件规定蛋白质饲料中检测抗生素残留的方法。因此，在保证与传统饲料具有相同营养价值的同时，需要保证其安全性，不会对动物、人类和生态产生不良影响。

张蒙蒙等[20]对青霉素菌渣提取的氨基酸进行分析，对比发现其与大豆蛋白饲料中的氨基酸相同，说明其具有作为蛋白质饲料的潜力。但是其未对蛋白质进行抗生素残留检测、有毒物质检测、急性毒性试验检测以及重金属含量等的检测。《有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力霉素的含量测定高效液相色谱法》(GB/T 32951—2016)为抗生素菌渣提取蛋白质的资源化利用提供了参考。

2 壳聚糖

2.1 提取现状

壳聚糖(chitosan)又名脱乙酰甲壳素，是在碱性条件下通过甲壳素部分脱乙酰之后得到的一种天然氨基多糖，具有良好的生物降解性、抗氧化性和抗菌性等特性，其脱乙酰度的不同，是影响壳聚糖性能的最重要的化学特征之一[21]。甲壳素和壳聚糖是丰富的天然有机化合物，被认为是具有巨大未来潜力的材料，具有进行结构修饰以赋予所需特性和功能并增加其在各种科学领域中无数应用的巨大可能性[22]。甲壳素广泛存在于海洋甲壳类动物的外壳及真菌、植物的细胞壁中[23-24]。目前主要以虾、蟹壳为原料，采用化学法提取壳聚糖，可以有效去除有机盐[25-26]。但是壳聚糖的理化特性因批次而异，这是由于虾、蟹原料的季节性、壳的质量、存在的物种、气候和过程控制的困难。因此，近年来中外有关从易培养且产量稳定的真菌中提取壳聚糖研究也越来越多。

壳聚糖提取的关键在于对其脱乙酰基的研究。王传芬[27]以青霉素菌渣为原料提取壳聚糖，首先利用3%的HCl蒸馏处理，然后用15%的NaOH蒸馏处理，固液比均为1∶15，去除其中的蛋白质。其次将双氧水脱色后的菌渣在50%NaOH处理2.5 h，固液比1∶15，温度110 ℃的条件下进行脱乙酰反应从而制备壳聚糖，壳聚糖产量为13.02%。其生产的壳聚糖的产品性能指标与壳聚糖标准比较，所得产品优良，达到食品级要求。由于浓碱法会容易对环境造成污染，Sebastian等[28]以真菌为原料提取壳聚糖，在微波功率300 W下反应22 min，在1N NaOH下脱乙酰提取壳聚糖，使蛋白质降解，其脱乙酰化程度可达94.6%，较常规加热法提高10%，壳聚糖产率为14.43%。魏燕等[29]采用电解高压的方法从发酵后的黑曲霉中提取壳聚糖。首先在菌株与3%NaOH溶液的体积比为1∶12，电压为8 V条件下电解1.25 h，去掉蛋白质和脂类等有机物，再在碱性条件下，表压689.5 Pa，121 ℃，反应2 h，再脱乙酰得到壳聚糖，其脱乙酰程度为89.81%，壳聚糖产率为15.6%。但该工艺相对比较复杂，且能耗较大。此外，长时间使用高浓度化学试剂可能会导致聚合物过度水解，溶解的蛋白质和矿物质也不能用作人和动物的营养物质。这些条件会产生大量废物，并严重污染环境。

因此，生态友好的生物法近年来越来越受到关注，其还能防止由酸和碱处理引起的不规则的脱乙酰化和分子质量降低的问题。由于从抗生素菌渣中提取壳聚糖的研究较少，参考其他真菌的生物法提取。Cai等[30]采用溶菌酶、中性蛋白酶和甲壳素脱乙酰酶提取柠檬酸废菌体中的壳聚糖，酶在应用过程中可以通过固定化酶技术，使其不溶于水，增加酶的重复使用率。

2.2 应用现状

壳聚糖作为一种天然的高分子材料，由于其生物降解性、生物相容性、抗菌性、抗氧化剂活性和高安全性，现广泛应用于食品加工、药物合成、保健品、水处理等领域[31-33]。

壳聚糖具有优异的生物学特性，可以抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，发挥抗氧化活性和抑制转移，这主要取决于活性基团中的氨基、羟基可以与自由基反应。同时，其具有良好的生物可降解性，具有清除能力。因此，在生物医药领域[34]，壳聚糖及其不同化合物广泛应用于可再生医学[35]、抗肿瘤活性[36]和抗菌剂[37]等方面。壳聚糖中游离的氨基和羟基在弱碱性条件下产生正电荷[38]，可以有效中和带负电荷的藻类细胞，产生消毒副产物，可以除去水中的有机污染物，且由于其自身可降解，不会形成二次污染[39]。在水处理中，可应用于絮凝[40]、金属离子吸附[41]、染料脱色[42]等领域。

壳聚糖在食品保鲜等方面也起着重要的作用，由其制作的薄膜具有良好的生物相容性、化学稳定性、无毒无害等特性。壳聚糖薄膜不仅阻隔了空气进入膜内，同时也能抑制病原微生物与果蔬接触，而且可以使细胞呼吸的二氧化碳顺利排出，从而达到果蔬保鲜的目的。同时壳聚糖及其衍生物的抗菌性和抗氧化性等特性也可以有效地抑制肉类的脂肪氧化，防止其中的蛋白质变性，延缓腐败，抑菌保鲜，延长肉类的高品质时期[43-46]。

3 麦角固醇

3.1 提取现状

麦角固醇又名麦角甾醇，是真菌细胞膜的主要成分之一，被广泛用作活菌生物量的指标分子[47]。游离的麦角固醇在细胞膜的流动性、渗透性和完整性中起重要作用，酯化的麦角固醇在固醇稳态中起作用[48]。目前，麦角固醇主要从酵母菌、霉菌和真菌中，运用物理化学方法提取，但其生长周期长，生产成本较高。因此，每年产量巨大的抗生素菌渣则成为麦角固醇提取的新来源，不仅降低了成本，而且解决了抗生素菌渣的环境问题，适用于工业化。

麦角固醇的提取过程为需先裂解细胞壁，再加入碱与醇混合使其皂化，最后通过有机溶剂萃取剂将麦角固醇提取出来。Wang等[49]以黄青霉素菌丝体为原料，通过碱热法破壁，采用NaOH将麦角固醇皂化以游离的形式释放，最后用石油醚将麦角固醇萃取出来。由于石油醚会危害环境，并且其蒸汽会影响人类健康，不适宜用于工业生产。刘玲等[50]以青霉素废菌丝体为原料，采用碱溶液皂化麦角固醇，去掉纤维素、无机盐和大部分蛋白，再加水酶解，使其分离纯化，最后乙醇萃取和旋蒸得到麦角固醇。通过正交试验法得到了提取麦角固醇最佳条件为：在15%NaOH条件下，物料皂化剂比1∶15，温度85 ℃下皂化2 h，再加入2.0%碱性蛋白酶，在温度45 ℃，pH8.0的条件下酶解2 h，得到的麦角固醇的纯度为70%，提取率为95%。随着现代生物分离和纯化技术的日渐成熟，将产物产业化、工业化运行均可通过中试实验实现。骆昆[51]对青霉素废菌丝体中提取麦角固醇做了中试研究，对提取方法进行改进，并重选选择了仪器设备，确定了沉降过程的絮凝剂，选择用板框过滤法对破壁液进行固液分离，对结晶过程中的有机溶剂进行回收并重复使用。麦角固醇的提取率较试验阶段有所下降，但纯度相同，可以满足维生素D2源的要求。王滋涵等[52]提出在低温和避光条件下从青霉素发酵菌丝体中提取麦角固醇制备微生态的工艺，不仅方法简单，生产成本低，还能带来可观的经济效益，1 t废菌渣可产生5 000元的经济效益。

利用抗生素菌渣提取麦角固醇不仅取得了不错的效果，而且具有一定的生态优势，拓宽了麦角固醇提取来源。但也存在一定的问题，如菌渣中麦角固醇的含量少，仅有0.04%～1.6%，产量低，提取工艺复杂。在选择有机溶剂萃取时，不仅要考虑提取率问题，还应考虑其对环境的影响。

3.2 应用现状

麦角固醇可以增强人体抵抗疾病的能力，当机体在受到外来细菌、病毒等侵袭时，免疫系统会做出相应的反应以维持机体内环境的稳定。麦角固醇可以抑制T淋巴细胞，增强机体免疫力[53]。并且其具有一定的抑菌活性，能对金黄色葡萄球菌等产生一定的抑制作用[54]。脂质过氧化失衡会损害人体，并与肿瘤、感染、炎症、自身免疫性疾病以及心血管和脑血管疾病的形成有关。麦角固醇作为潜在的天然抗氧化剂，在人类抗脂质过氧化物中起重要作用[55]。同时在细胞损伤后，经过麦角固醇处理后的细胞活性氧含量降低，起到保护和修复受损细胞的作用。恶性肿瘤表现为细胞的异常生长，后向组织浸润，引起主要器官功能衰竭，而导致死亡，这也成为当前危及人类健康的主要疾病之一。麦角固醇可以促使肿瘤细胞凋亡、抑制实体瘤生长，其衍生物可以调控蛋白的表达，继而发挥抗肿瘤的作用[48]。抑郁症作为一种慢性综合征，不仅给患者带来极大的精神痛苦，还影响社会以及家庭和谐。轻度抑郁症以心理治疗为主，而中、重度患者则以药物治疗为主，辅以心理治疗。经研究发现，麦角固醇及其衍生物由γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸介导，使其产生抗抑郁活性，从而起到治理抑郁症的作用[56]。麦角固醇也是重要的脂溶性维生素D2源，对调节体内的钙磷代谢具有重要作用，可用于慢性低钙血症、低磷血症、佝偻病及伴有慢性肾功能不全的骨软化症等的治疗[57]，且可以作为饲料添加剂添加在饲料中，增加畜禽的产蛋率和孵化率。麦角固醇也可以作为重要的医药化工原科，用于生产可的松、激素黄体酮等甾醇类药物[58]，具有良好的应用价值与发展前景。

抗生素菌渣因其产量大，生产集中，所以其后续处置困难，如果将其中的活性物质如蛋白质、壳聚糖、麦角固醇的提取过程设计合理，如图1所示，不仅可以使菌渣达到减量化的目的，同时也可实现其资源利用最大化，工业生产前景可观。

图1 蛋白质、壳聚糖、麦角固醇提取工艺流程图Fig.1 Extraction process flow chart of protein,chitosan and ergosterol

4 结论与展望

总结了近年来从抗生素菌渣中提取蛋白质、壳聚糖、麦角固醇等活性物质应用现状，阐述了其中活性物质的应用价值和提取的必要性。但其仍然存在着诸多挑战。

(1)抗性基因去除。抗生素菌渣因其中的抗生素残留问题，会产生抗性基因，处置不当会使微生物产生抗药性，进而危害环境及人类健康。因此，在对菌渣进行活性物质提取的同时，应该对其中的抗性基因等进行检测及消除，如在提取活性物质之后进行电离辐射、臭氧等[16，61-62]处理，其方法适用性有待进一步研究。

(2)相关政策支持。抗生素菌渣制备的活性物质营养达标，但因其属于危险固废的特殊性，现在未能有明确的文件规定抗生素残留在多少时对环境无影响或影响较轻，这需要研究人员对实际应用中的危害性进行试验检测[16,61-62]，为相关政策的出台做理论支持。

(3)优化提取工艺。抗生素菌渣活性物质的提取，不同工艺有不同的优劣，工艺组合之间也有最适条件的掌控，因此寻求最适生产工艺且易于工业生产的工艺组合，需要研究者进一步的研究。

(4)后续废渣处理。抗生素菌渣提取活性物质之后，脱去细胞中水分的同时，会改变其中的碳氮含量，剩下的废渣可以用作生物炭、生物油等[63-64]的制备，从而进一步达到无害化、减量化的目的。

总而言之，对抗生素菌渣的资源化利用，旨在促进制药行业的低碳经济、绿色经济和循环经济发展。而各种抗生素菌渣资源化利用方式与途径也不尽相同。不管何种处理技术，最终目标都是要消除各种不利因素的影响，提高处理效率，降低处理成本和实现资源最大化，寻找最佳处理工艺。