非编码RNA在骨肉瘤中的研究进展

谢文鹏，孙晓栋，梁延琛，常文杰，刘 飞，张永奎

骨肉瘤是起源于间叶组织的原发恶性骨肿瘤，好发于25岁以下儿童和年轻人的四肢长骨[1]，其发病原因及机制尚不明确。目前，骨肉瘤公认的治疗模式是手术切除并联合术前、术后新辅助化疗，尽管化疗方案不断完善，治疗效果提高，但骨肉瘤患者的5年生存率仍为60%～70%，这主要是由于化疗药物的毒副作用以及缺乏特异性分子作用靶点所致。因此，寻找骨肉瘤治疗的特异性分子靶点，进而研发疗效确切、安全性高的靶向药物，对改善骨肉瘤患者预后、提高生存率具有十分重要的意义。

非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)是指不被翻译成蛋白质的RNA，主要包括微小RNA(microRNA, miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)、环状RNA(circular RNA, circRNA)等。它们的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，在RNA水平发挥各自的生物学功能。ncRNA与诸多分子靶目标结合形成调控网络，进而启动特定的细胞生物应答，具有调控基因表达、影响细胞内信号传递、参与表观遗传修饰等多种生命活动的功能，进而在肿瘤等疾病的发生、发展中发挥作用。近年有证据表明[2]，ncRNA与骨肉瘤的发生、发展、诊断、治疗和预后等密切相关，可作为骨肉瘤早期诊断的新型分子标志物和治疗靶点，是骨肉瘤相关的前沿研究领域。本文通过查阅相关文献，对ncRNA在骨肉瘤领域的研究进展作一综述。

1 miRNA在骨肉瘤中的研究进展

1993年Lee等首次发现miRNA是内源性非编码单链线性的RNA，全长19～25个核苷酸，具有一定的分子特异性和靶向性，是调控基因转录的重要因素，可通过竞争性结合并降解靶mRNA的3′UTR发挥作用。随着高通量测序技术的发展，多篇文献报道骨肉瘤中的miRNA表达谱，且miRNA已在骨肉瘤的发生、诊断、治疗及预后等领域中取得一系列的研究进展。

1.1 miRNA与骨肉瘤细胞增殖、凋亡根据miRNA在肿瘤发生和发展中的功能，将其分为抑癌miRNA和致癌miRNA两大类。在骨肉瘤中，抑癌miRNA表达下调，致癌miRNA表达上调。已有研究证明miRNA可以通过调控肿瘤细胞中相关凋亡基因的表达以及影响细胞周期，进而改变增殖和凋亡水平，在骨肉瘤的发生、发展以及治疗预后中发挥作用。Cyclin D1被称为原癌基因，它是细胞有丝分裂的信号传感器，其在细胞内高表达会明显缩短细胞周期，从而加快细胞增殖促进疾病发展。miRNA-195是调控Cyclin D1表达水平的关键基因。SASH1(SAM-and SH3-domain containing 1)基因是公认的抑癌基因，在多种肿瘤细胞中表达下调。miRNA128能够靶向降低SASH1表达，进而促进骨肉瘤细胞增殖[3]。

蔡启轩等[4]分别从GPL8227、GPL19631两组数据库筛选骨肉瘤中共同的差异表达52个miRNA，其中31个miRNA上调表达，21个miRNA下调表达。这些差异表达的miRNA通过改变骨肉瘤细胞的自噬、增殖及凋亡水平，进而影响骨肉瘤的发生、发展。体外细胞实验研究表明，miR-144[5]、miR-1225-5p[6]等可以通过抑制细胞增殖、促进凋亡来抑制骨肉瘤的进展。miR-522-3p[7]、miR-421[8]可以促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移。

1.2 miRNA与骨肉瘤细胞自噬20世纪50年代，比利时生物学家Christian de Duve首次提出细胞自噬的概念。自噬与中医气化及阴阳平衡理论一致，当自噬能力降低时，人体内气化功能下降，气血运行不畅，气滞成瘀，瘀聚生毒，瘀毒搏结，瘤块乃成；体内代谢产物不能及时被降解，这些代谢产物相当于中医的“瘀毒”，为肿瘤的发生营造良好的微环境。机体通过提高自噬活性，能够有效清除肿瘤细胞内的“瘀毒”，改善机体阴阳环境与稳态，这与阴阳自和平衡理论相似。Beclin 1的激活是诱导骨肉瘤细胞自噬的关键机制，文献报道高迁移率族蛋白1可调控Beclin 1/Vps34复合体的形成，激活骨肉瘤细胞自噬，并降低对化疗药物耐药。目前，自噬在骨肉瘤中的发生机制尚不清楚，限制了靶向诱导自噬治疗该病药物的挖掘。

第一个被鉴定为自噬调节因子的miRNA是miR-30a，它以多种癌细胞中的BECN1基因为靶点[9]，随后陆续有研究报道miRNA在骨肉瘤细胞自噬中的作用。Dong等[10]发现miR-193b通过促进FEN1介导的自噬增加骨肉瘤细胞的化疗敏感性。Yu等[11]证实miR-100可以靶向调控mTOR增强顺铂诱导骨肉瘤细胞自噬和凋亡。Wang等[12]通过实验发现miR-155可以通过调节PTEN-PI3K/AKT/mTOR信号通路，影响阿霉素诱导的骨肉瘤MG-63细胞自噬。

自噬在骨肉瘤发生、发展中具有重要作用，如何在保证正常细胞存活的前提下诱导骨肉瘤细胞死亡，是miRNA 靶向调控骨肉瘤细胞自噬机制面临的重大挑战。

1.3 miRNA与骨肉瘤细胞侵袭、迁移骨肉瘤是好发于青壮年的、恶性程度高、预后差的肿瘤，因此早期预防和控制骨肉瘤细胞的侵袭和转移是治疗骨肉瘤的重点研究方向。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)可以降解细胞外基质及基膜，进而促进肿瘤细胞发生侵袭及远处转移；缪吴军等[13]实验表明，miR-203通过调节MMP-9的表达进而控制细胞的侵袭与转移。另外，有研究表明miR143可以靶向调控MMP-13的表达，抑制骨肉瘤细胞的转移[14]。此外，相关功能研究表明miR-3677高表达抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移[15]，与miR-29a作用趋向一致[16]。miRNA对骨肉瘤细胞的浸润和转移等恶性生物学特性的靶向调节作用将会成为未来研究的热点。

虽然miRNA与骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、自噬等密切相关，为骨肉瘤临床的早期诊断、分子靶向治疗、预后判定提供新思路和挑战，但也必须认识到miRNA与骨肉瘤的研究还面临诸多困难。首先，还有大量与骨肉瘤相关的miRNA尚未发掘；其次，miRNA与信号通路之间的反馈调控机制尚不明确。同时miRNA与骨肉瘤关系的实验研究中也存在较多问题，如miRNA制备过程中数量和质量的不稳定性以及辨别miRNA靶点和验证miRNA生物功能的复杂性等。

2 lncRNA在骨肉瘤中的研究进展

lncRNA是长度大于200个核苷酸的ncRNA，大多数是RNA聚合酶Ⅱ的转录产物，可分布在细胞质和细胞核中。lncRNA可以影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等，同时也可用作胃癌、肝癌和结肠癌等的早期诊断和预后判断的标志物。随着科学技术的突飞猛进，目前lncRNA在骨肉瘤中的作用成为研究热点。

2.1 lncRNA与骨肉瘤细胞增殖、凋亡在骨肉瘤组织中，表达上调的lncRNA有三十余种，主要包括lncRNA MALAT1、SNHG1、TUG1、DANCER、ATB、HOTAIR、UCA1、SOX4、CATT2、H19、NTT-AS1等；表达下调的lncRNA有十余种，主要包括lncRNA P21、CAS5、LINC-00629、MEG3、NBR2、NKILA等[17]。DANCR可诱导骨肉瘤中miR-335-5p和miR-1972促进ROCK1介导的细胞增殖和凋亡[18]。Huang等[19]发现lncRNA BE503655在骨肉瘤细胞中表达水平升高，而沉默lncRNA BE503655表达会抑制骨肉瘤细胞系增殖并诱导细胞凋亡。同时发现Wnt/β-catenin信号通路发生差异表达，因此猜测lncRNA BE503655可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路进而促进骨肉瘤的细胞增殖。此外，lncRNA可以改变miRNA的活性，进而促进骨肉瘤的发生、发展，如通过lncRNA TUG1-miR153、lncRNAXist-miR 320b-RAP2B、lncRNA ATB-miR 200-ZEB1/ZEB2等调控骨肿瘤细胞的增殖[20]。

骨肉瘤细胞中并不是所有的lncRNA表达水平均升高，Yang等[21]发现骨肉瘤细胞中lncRNA NEF表达下调，miR21表达水平增高，而过表达lncRNA NEF后，miR21表达水平随之降低，同时骨肉瘤细胞的侵袭和迁移水平受到明显抑制。

2.2 lncRNA与骨肉瘤细胞自噬研究表明lncRNA是调控肿瘤细胞自噬的关键靶点，其调节自噬的具体机制可以分为三类：首先，lncRNA可以充当竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA, ceRNA)，进而结合miRNA以影响自噬进程。miRNA可以在转录后水平上调节基因表达，而很多研究发现lncRNA上含有某些特定的miRNA结合位点，可以与mRNA发生竞争关系，进而影响相关miRNA的分布和靶基因表达，从而在细胞自噬中发挥调节作用。Zhu等[22]通过实验发现lncRNA Sox2OT-V7通过竞争性结合miR-142/miR-22促进阿霉素诱导的骨肉瘤自噬。其次，lncRNA也可以顺式或反式影响自噬相关基因(autophagy related genes, ATG)的表达，ATG可以调节自噬体的囊泡成核、自噬体膜的伸长和自噬体完成等过程。Gu等[23]通过实验发现，lncRNA DICER1-AS1可以靶向调控ATG5的表达来诱导骨肉瘤细胞发生自噬。此外，lncRNA还可以靶向调节AKT/mTOR信号通路进而抑制肿瘤细胞自噬，AKT/mTOR信号通路是调节自噬的核心通路，在肿瘤发生、发展及病理演变中发挥重要作用。Unc-51样激酶1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1, ULK1)是引发自噬起始的关键分子，作为mTOR 分子的下游，mTORC1(mTOR的活化状态)使ULK1磷酸化而失活，从而起抑制自噬的作用。Sun等[24]发现lncRNA XIST可以海绵吸附miR-375-3p靶向AKT/mTOR信号通路，调控骨肉瘤细胞自噬。

目前，lncRNA在不同肿瘤细胞中对自噬水平的调节作用仍有较大争论，而且在肿瘤发展的不同阶段中，细胞自噬的水平及其对细胞的作用也不尽相同。lncRNA在骨肉瘤自噬调节中的作用机制尚未明确，与多种通路相互作用、相互联系，形成复杂的调控网络，共同调控肿瘤细胞的生长和死亡。关于lncRNA 在骨肉瘤细胞自噬中的机制研究，还有待进一步探索。

2.3 lncRNA与骨肉瘤细胞侵袭、迁移的关系在骨肉瘤基础研究领域，lncRNA的差异表达也是导致其发生侵袭和迁移的主要因素。如曹飞等[25]应用慢病毒空载对照(LV-NC)和慢病毒lncRNA-SRLR过表达载体(LV-over/SRLR)转染骨肉瘤U2OS细胞，并建立细胞稳转株U2OS/NC和U2OS/SRLR，进而通过qRT-PCR等技术发现lncRNA-SRLR可能通过作用于PLOD2，激活FAK/STAT3通路诱导U2OS细胞的侵袭和转移。LUCAT1在甲氨喋呤耐药的骨肉瘤细胞中特异性过表达[26]，敲低LUCAT1不仅抑制体内外骨肉瘤细胞的甲氨喋呤抗性，同时降低药物抗性相关基因(MDR1、MRP5、LRP1)的表达水平。此外，FOXC2-AS1在多柔比星耐药的骨肉瘤中也存在异常表达[27]，OIP5-AS1在顺铂耐药的骨肉瘤细胞中表达上调[28]。因此，他们均可以作为骨肉瘤细胞耐药性的预测因子，但还需进一步的临床实验来证实。

3 circRNA在骨肉瘤中的研究进展

研究证实，circRNA的形成模板主要有外显子circRNA(ecRNA)、内含子circRNA(ciRNA)以及外显子-内含子circRNA(EIciRNA)三种。circRNA由许多蛋白质编码基因产生，大部分积聚在细胞质中，但其定位或核输出的调控机制尚不清楚，目前已发现32 000个circRNA[29]。越来越多的证据表明[30]，circRNA可以作为miRNA海绵，调控相关miRNA，进而改变下游信号通路及相关因子的表达，影响肿瘤细胞自噬、增殖、凋亡等进程。其次circRNA还具有调节RNA结合蛋白、翻译蛋白、调控亲本基因表达的作用，在神经系统疾病、心血管系统、消化系统疾病及肿瘤等领域均积累一定的研究成果。随着研究的不断深入，circRNA与骨肉瘤的联系正在被挖掘：(1)circRNA作为促癌或抑癌因子调控骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、自噬、侵袭和迁移等生物学行为，调节化疗或靶向药物的敏感性，为辅助临床治疗提供初步理论基础；(2)组织或血液中circRNA的差异表达在骨肉瘤患者的早期诊断及预后评估均具有相关性，有望成为骨肉瘤潜在的生物学标志物。

3.1 circRNA与骨肉瘤细胞增殖、凋亡的关系既往研究结果表明，circRNA在骨肉瘤细胞及组织中存在特异性及差异性的表达。尽管对circRNA 的研究正处于起步阶段，但已经成为ncRNA研究领域中的新方向。Gao等[31]实验结果显示，circRNA 0001721可以通过靶向调控miR-372-3p/MAPK7信号轴，抑制骨肉瘤细胞凋亡的同时促进细胞增殖。也有研究[32]发现，circRNA LRP6在骨肉瘤中表达量上升，通过调控KLF2和APC的表达促进骨肉瘤细胞的增殖。

目前，关于circRNA在骨肉瘤细胞增殖、疾病发生、发展中发挥的具体生物学功能及其机制尚未明确，但随着高通量测序技术的逐步完善，越来越多的骨肉瘤测序数据以及ncRNA的网络作用关系被报道，为骨肉瘤基因治疗提供新方向。

3.2 circRNA与骨肉瘤细胞自噬的关系研究证实，circRNA在细胞的增殖、分化和凋亡过程中发挥重要作用。近年关于circRNA在细胞自噬中的作用日渐受到重视。Zhou等[33]研究表明，circRNA ACR可通过调节Pink1/FAM65B 途径抑制自噬来减弱心肌缺血/再灌注损伤。Tang等[34]发现circRNA hsa-circ 0000515作为miR-326海绵，可以通过上调ELK1诱导子宫颈癌细胞自噬进而促进其进展。Jiang等[35]查阅文献发现，circRNA作为miRNA海绵，可以通过诱导胰腺癌细胞自噬影响其发生、发展和转移。Meng等[36]发现circRNA ciRS-7通过充当miR-1299海绵靶向EGFR信号抑制食管鳞状癌细胞自噬。目前，circRNA在骨肉瘤中的研究还处于初级阶段，分析circRNA作为miRNA海绵，吸附miRNA进而影响骨肉瘤细胞的自噬。

3.3 circRNA与骨肉瘤细胞侵袭、迁移的关系Liu等[37]研究发现骨肉瘤细胞中有252种差异表达的circRNA，其中有71种表达上调，181种表达下调，应用qPCR检测进一步验证了表达上调的6种circRNA(102049、103309、103801、101113、102485、100241)和下调的6种circRNA (104692、104892、102678、103110、100258、104980)，证实他们均可以参与骨肉瘤细胞的侵袭、迁移。

Deng等[38]发现has circ 009910作为miR-449a的分子海绵，调节JAK1/STAT3信号通路及骨肉瘤细胞的侵袭和迁移。Jin等[39]发现circRNA 0016347在骨肉瘤的增殖、迁移及转移中发挥重要作用，能有效促进骨肉瘤细胞的侵袭和迁移。Kaplan-Maier分析显示circRNA HIPK3低表达与骨肉瘤患者的总生存率和预后较差相关，进一步研究表明HIPK3过表达显著抑制细胞的增殖、迁移和侵袭[40]。

circRNA结构稳定、丰度高、有一定的组织特异性和疾病特异性，有望成为临床诊断的生物学标志物和治疗靶点，但目前均为体外研究，结果还需要在体内验证。

4 小结

越来越多的研究表明，ncRNA在骨肉瘤的发生、发展、诊断、治疗中具有重要意义。然而，对于ncRNA在骨肉瘤中的作用研究尚处于探索阶段，许多ncRNA的结构、功能及作用靶点尚不明确；深入分析骨肉瘤中ncRNA的表达变化以及相互作用机制，可以为骨肉瘤的诊疗提供新的突破。目前，将ncRNA应用于骨肉瘤患者的临床治疗仍面临较多困难，但随着对ncRNA在骨肉瘤中作用机制的分析，将为骨肉瘤的临床治疗提供新靶点。