镉的卵巢表观遗传毒理学研究进展

杨劲松(综述)，张文昌(审校)

环境污染导致的疾病负担已成为全球的健康挑战[1]。镉(cadmium, Cd)是一种毒性重金属，被工业化国家归为主要环境和职业性化学污染物[2-3]，其引发的健康危害仍是重要的公共卫生问题。在镉的非职业性暴露中，吸烟和饮食是主要的途径[4-5]。动物实验和流行病学资料显示，长期镉暴露与多器官损伤及疾病密切相关，包括肝病、肾病、心血管疾病、肿瘤、生殖疾病等[3]。卵巢作为重要的女性生殖器官，也是镉的主要作用靶点[6]。

近年来，表观遗传学成为生命科学研究的一大热点。表观遗传学调控是研究基因的修饰，并在不改变DNA序列和结构修饰的情况下控制和调控基因的表达，其机制主要包括DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰和非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)。这些过程可能受到各种环境因素的影响，其失调与多种疾病有关[7-8]。本研究拟探讨镉的卵巢表观遗传毒理学进展。

1 镉对DNA甲基化的影响

DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点(Cytosine-phosphate-guanine sites, CpGs)二核苷酸5’端的胞嘧啶添加甲基后变成5’甲基胞嘧啶的过程，DNA甲基化主要依靠DNMT的催化和维持，其在调控基因的表达和细胞生长发育过程中发挥重要作用[9]，如调控胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)基因，X染色体失活、基因组印迹、细胞分化、老化等功能基因的表达。在生殖细胞和胚胎生长发育过程中，DNA甲基化模式经历去甲基化及重新甲基化的过程，调控特异基因的活化与失活，进而保证卵子和胚胎的正常生长[10]。镉暴露后卵巢细胞DNA甲基化异常主要表现在以下几个方面：

1.1 镉对基因组总甲基化的影响 基因组总甲基化水平的改变会增加基因组的不稳定性，镉暴露能影响基因组总甲基化的水平，并与卵巢功能失调密切相关。妊娠期镉暴露对F1代大鼠成年后颗粒细胞全基因组 DNA 启动子区甲基化产生影响，与对照组比较，8.0 mg/kg 镉暴露组基因组 DNA 发生低甲基化的数量高于发生高甲基化的数量，且主要发生在中、高密度启动子区[11]。镉可导致卵巢功能的异常，参照职业镉暴露剂量对雌性大鼠进行亚急性染毒，会导致多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)和卵巢功能早衰[12]。流行病学调查证实，甲基化异常与PCOS关系密切。与对照组比较，PCOS组颗粒细胞表现出差异甲基化水平；2 977个CpGs(代表2 063个基因)存在低甲基化，而2 509个CpGs(1 777个基因)存在高甲基化[13]。以上研究提示，镉可能通过参与卵泡发育重要过程的基因组甲基化水平失调引发妇女的卵巢缺陷。

1.2 镉对DNMTs活性的影响 在哺乳动物中，有3种DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3α和DNMT3β[14]，在着床期胚胎和生殖细胞分化过程中，DNMT3α和DNMT3β通过其新生型DNA甲基化活性建立DNA甲基化模式。一旦模式建立，维持型DNA甲基转移酶DNMT1就会通过复制将其忠实地传递到下一代[15]。镉暴露可致DNMTs酶类表达异常，进而引起DNA甲基化模式的改变。卵巢体外染镉实验结果显示，随着染镉剂量的增加(0～10 μmol/L)，卵巢细胞DNMT1、DNMT3α和DNMT3β的mRNA表达量呈递增趋势，表明较低浓度的镉能够促进DNMTs的转录，从而改变DNA甲基化状态[16]。

1.3 镉对基因启动子及基因表达的影响 镉暴露会诱导特定基因启动子DNA甲基化水平的变化，进而调节基因表达。断乳至性成熟大鼠镉暴露干扰了卵泡发育相关基因Figlα、H1foo、AMH及甾体激素合成相关基因StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1和CYP19A1的mRNA与蛋白表达水平；Figlα基因启动子区CpG岛甲基化在其mRNA表达下调中发挥作用；但CYP17A1和CYP19A1基因启动子区CpG岛甲基化水平未发生改变[11]，提示镉并非通过升高上述两种基因启动子区CpG岛的DNA甲基化水平，进而表现出其抑制mRNA表达的毒效应。进一步关注非CpG岛的DNA甲基化水平也是必要的，因其也可以参与调控基因的表达[17]。镉暴露还可导致F1代大鼠颗粒细胞Eif2s1等14个凋亡通路相关基因启动子区发生高甲基化，Bcl-xl基因启动子区发生低甲基化；激素合成基因Cyp1a1、Hsd17b1启动子区发生低甲基化，DNA甲基化可能参与抑制Eif2s1基因表达的调控[18]。

由于DNA甲基化通常发生在基因改变之前，是一类早期的效应标志物，因此，对生殖细胞DNA甲基化的及早检测有可能提示卵巢的损伤，为进一步防控生殖健康损害提供依据。

2 镉对组蛋白修饰的影响

组蛋白不仅是一种染色质结构蛋白，而且可作为基因表达的活性调节因子参与翻译后的化学修饰，修饰发生在组蛋白尾部的N端和C端，包括但不限于乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、类泛素化和ADP-核糖基化，这些修饰在调控基因转录相关过程中起着重要作用[19]。环境因素已被证明可以改变组蛋白修饰，从而改变基因转录的平衡[20]。镉暴露可诱导异常的组蛋白甲基化、乙酰化，导致机体生殖功能异常[21]。急性镉暴露后小鼠卵母细胞成熟和生育能力关键指标发生改变，卵母细胞发育受阻、质量下降，镉暴露组卵母细胞蛋白赖氨酸甲基化(H3K9me3)和乙酰化(H3K9ac)整体水平低于对照组，提示组蛋白修饰等途径可能影响卵母细胞成熟和受精能力[6]。雌鼠饮水镉(64 mg/L)暴露后，MⅡ期卵母细胞组蛋白H3第9位赖氨酸残基(H3K9)甲基化水平和H4第12位赖氨酸残基(H4K12)的乙酰化水平显著增强，说明卵母细胞的去乙酰化水平降低，影响染色体的正常分离，进而影响受精后受精卵的正常发育，表明镉暴露可通过介导雌鼠卵母细胞组蛋白甲基化水平影响雌鼠的生殖功能[22]。

3 镉对ncRNA的影响及调控

ncRNA是从DNA转录而来的功能性RNA，但未翻译成蛋白质[23]。ncRNA按长度常分为小ncRNA(sncRNA，<200个核苷酸)和长ncRNA(lncRNA，>200个核苷酸)[24]。大量证据表明，异常的ncRNA对女性类固醇激素分泌的影响和卵巢疾病的发生密切相关[25]。ncRNA在镉的生殖毒性作用中也发挥了重要作用。子痫前期(pre-eclampsia, PE)是一种以高血压和蛋白尿为特征的妊娠疾病，可对母亲和胎儿造成不利的健康影响。临床资料显示，microRNA(miRNA)失调是PE的一个重要特征，并随着镉暴露的增加而增强[26]。目前，有关ncRNA介导镉的卵巢毒性机制研究主要包括以下几个方面：

3.1 miRNA介导镉的卵巢毒性 miRNA是一种最典型的非编码RNA分子，包含21～22个核苷酸，根据碱基互补配对原则，miRNA与靶mRNA的3’非翻译区结合可导致靶mRNA降解或翻译抑制[27]。研究表明，miRNA参与了镉所致卵巢毒性作用的多个生理病理过程，通过对目的基因的靶向效应，调控卵巢细胞凋亡、雌孕激素合成及分泌等，现已成为镉的卵巢毒性表观遗传机制调控研究的重要组成部分。

3.1.1 镉诱导miRNA的表达异常 体内和体外研究表明，镉暴露可诱导卵巢组织和细胞miRNA表达谱发生改变。妊娠期F0代大鼠镉暴露(8.0 mg/kg)后，取F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞进行微阵列分析，共发现232个miRNA表达失调，111个表达量升高(fold change，FC≥1.5)，121个降低(FC≤0.67)[28]。颗粒细胞暴露于含10 μmol/L CdCl2的培养液4 h后，与对照组比较，335个miRNA表达失调(FC≥2)，191个表达量升高，144个降低，58个FC>10倍[29]。

3.1.2 miRNA表达异常与卵巢细胞损伤 镉暴露会导致颗粒细胞增殖与凋亡、生长发育、激素合成等相关靶基因以及信号通路调节细胞因子表达的改变，从而表现为卵巢和生殖毒性，多种miRNA参与调控这些损伤过程。

3.1.2.1 凋亡相关的miRNA Zhong等[30]探讨镉对大鼠卵巢颗粒细胞(ovarian granulosa cell, OGCs)凋亡或自噬是否通过miRNAs介导。结果显示，镉诱导的OGCs损伤是由线粒体凋亡而非自噬介导的，包括miR-204-5p和miR-29a-3p在内的19个凋亡相关的miRNA可能参与该过程。上调的miRNAs增加对Bcl2基因mRNA和蛋白表达的靶向抑制，促进细胞凋亡，从而在镉诱导的大鼠OGCs毒性作用中发挥重要作用。免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein,BIP)基因的诱导表达和PERK/eIF2α路径的激活是内质网应激继发细胞凋亡的关键，BIP的调控受到多种因素的影响。镉可通过诱导内质网应激致卵巢颗粒细胞发生损伤。有研究探讨了miRNA调控BIP的可能性，筛选出5个与BIP相关的miRNA：miR-199a-5p、miR-181a-5p、miR-495、miR-30b-3p及miR-150-5p，但经qRT-PCR检测后发现，各剂量染镉组5个miRNA均无明显变化，它们可能未参与BIP基因表达的调控[31]。

3.1.2.2 生长发育相关的miRNA Kitl作为一种旁分泌因子，在卵泡早期发育过程中发挥了重要作用[32]。Wang等[29]研究miRNA对小鼠卵巢颗粒细胞Kitl pre-mRNA选择性剪接的影响，将芯片结果与Kitl以及选择性剪接重要因子hnRNPA1、hnRNPD、SR基因靶miRNA预测结果、文献资料的查阅结果进行比对，取交集，最终得到29个与Kitl基因表达调控相关的miRNA，其下游靶基因可能紧密参与了细胞增殖生长分化、细胞凋亡调控、应激适应、炎症反应等毒作用效应。抗苗勒激素(anti-mullerian hormone，AMH)由早期发育卵泡中的颗粒细胞分泌，通过自分泌和旁分泌途径发挥作用，使得原始卵泡的募集受到抑制，参与优势卵泡的选择，从而调节卵泡的生长发育[33]。镉能通过上调AMH负调控干细胞因子的表达参与大鼠卵巢细胞损伤；各染毒组miR-129-5p、miR-486、miR-503-3p及miR-871-3p表达水平降低；miR-133a-5p、miR-138-5p、miR-325-3p及miR-615表达水平上升，提示它们可能参与调控镉暴露所致的AMH表达水平的改变[34]。

3.1.2.3 甾体激素合成相关的miRNA 庄思琪[28]将镉暴露后F1代成年大鼠颗粒细胞激素合成基因的靶miRNA进行筛选。根据微阵列芯片表达谱、在线预测软件以及文献综述，筛选出10个相关miRNA，8个miRNA经qRT-PCR确认。GO分析富集到3个与雌孕激素相关的生物过程，分别为细胞内雌孕激素受体信号通路，类固醇激素介导的信号通路和胆固醇代谢过程；Pathway富集到4个与雌孕激素作用相关的通路，分别为MAPK信号转导通路、孕酮介导卵母细胞成熟、雌孕激素信号通路以及PI3K-Akt信号通路[28]。

3.1.3 镉对miRNA表达调控的影响 当前研究工作主要聚焦于miRNA异常表达影响靶基因转录后的表达和调控，但对于miRNA本身受到的表达调控研究很少。研究发现，miR-92a家族基因在个体发育、细胞的增殖、凋亡与分化、肿瘤发生及发展中发挥着至关重要的作用[35]。宗超威[36]曾深入研究miR-92a在镉致颗粒细胞凋亡中的调控作用及miR-92a本身可能受到的调控机制，发现miR-92a-2-5p通过靶向抗凋亡基因Bcl2，参与镉致卵巢颗粒细胞凋亡的过程；上调的转录因子c-myc促进了miR-92a-2-5p的转录过程；虽然DNA甲基化转移酶水平降低，但miR-92a-2-5p的DNA甲基化可能未参与其表达的调控。

3.1.4 miRNA介导镉的卵巢毒性跨代遗传 近年来研究发现，当亲代暴露于不利环境因素时，易通过跨代遗传引起子代生理功能紊乱[37]。miRNA不仅介导镉所致亲代卵巢颗粒细胞的损伤和功能障碍，还可在不同代际进行跨代调控，表现出不同的生物学效应。F0代大鼠妊娠期镉暴露后，F1代成年大鼠颗粒细胞miR-16和miR-92a表达上调并靶向下调Bcl2，从而参与凋亡过程；然而，F2代成年大鼠颗粒细胞未出现明显凋亡改变，miR-92a的下调可能发挥了抑制凋亡的作用[38]。Liu等[39]筛选出10个与孕期镉暴露F1代成年大鼠卵巢颗粒细胞雌孕激素作用通路及合成相关的miRNA，其中miR-27a-3p和miR-10b-5p可调控孕期镉暴露致F1代成年大鼠颗粒细胞雌孕激素的合成；镉对于F2代的雌孕激素合成功能仍具有影响，miR-27a-3p和miR-10b-5p主要通过抑制STAR基因翻译过程来影响雌孕激素合成功能。miRNA介导的毒性跨代遗传和调控机制十分复杂，这种跨代遗传的持续性和危害性尚需进一步评估。

3.2 lncRNA介导镉的生殖毒性 lncRNA是一类长度超过200个核苷酸但缺乏蛋白编码序列的转录产物[40]。研究表明，lncRNA可以在转录后、转录、翻译和翻译后等不同水平调控基因表达[40-41]。目前，镉暴露后对生殖器官和细胞lncRNA表达变化的研究还十分少见。有研究证实，胎盘内lncRNA表达与胎盘镉浓度和体质量之间的相关性，lncRNA表达失调可能是镉生殖毒性机制的一部分[42]。镉暴露会导致C57BL/6J小鼠睾丸和精子lncRNA的差异表达，这些失调的lncRNA可能是镉诱导的雄性生殖毒性的潜在生物标记。基因本体和KEGG路径分析表明，差异表达的功能lncRNA的靶标与多种生命活动密切相关，如胞质钙运输、大分子代谢过程、细胞分化和周期等，这些生物事件和途径已被证实与精子的产生、活力、形态和运动有关[43]。笔者推测，lncRNA也参与了卵母和颗粒细胞生理功能的调控，有待深入研究。

4 展 望

尽管表观遗传学改变与环境风险因素所致健康损伤的密切相关性已得到了公认，但为了进一步掌握卵巢毒性损伤的表观遗传调控机制，仍需更加深入的研究。首先，在动物实验和细胞实验中，重金属不同暴露剂量和时间的表观遗传改变不尽相同，研究结果必然会存在差异，外推到人群尚有不小的难度，有必要进行前瞻性的大队列研究，以明确其致病作用。其次，表观遗传修饰在调控基因表达的同时，本身也受到多因素的调控，如镉暴露于颗粒细胞后，上调的转录因子c-myc促进了miR-92a-2-5p的转录过程。如果能发现和证实更多调控miRNA表达的通路和机制，可为治疗细胞损伤提供新的策略。最后，miRNA介导环境因素毒性的跨代遗传是当前生殖毒理学的研究前沿,生殖细胞可能作为媒介,在代际间传递表观遗传标记以实现有害环境影响的跨代遗传。然而，该假说涉及的调控机制十分复杂，不同miRNA在不同代际生殖细胞中的表达并不相同，推测其因不同的基因靶向作用，受到更高层次的表达调控，从而维持生殖细胞的自身稳态。未来可通过系统比较动物实验结果和人群临床数据，研究这些跨代遗传的精准运行机制。