基于熵权-AHP法结合响应面法优化复方黄芪方絮凝工艺

赵馨雨，赵颖，邓莉莉，刘玉娟，郭子右，吴清

北京中医药大学 中药学院，北京 102488

中药提取液的除杂纯化工艺是制备中药制剂的重要环节，传统水提醇沉法存在生产周期长、有效成分损失多等不足[1]，已不能满足当今中药的质量要求[2]。絮凝纯化技术利用絮凝剂与中药提取液中的杂质结合生成絮凝团，经沉降分离以除去杂质[3]，避免了高浓度乙醇对有效成分溶解度的影响[4]，有利于有效成分的保留。本实验研究的复方黄芪方由黄芪、山楂等药味组成，具有辅助治疗高脂血症的功效[5]。其水提液中山楂含有的黄酮类成分具有调血脂作用[6]；黄芪为方中君药，黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分，具有调节脂肪代谢的药理作用[7]，两者为主要药效成分；同时，水提液中还含有蛋白质、鞣质、纤维素等杂质成分，此类成分导致水提液浑浊、不稳定及服用量增加等问题[8]。絮凝法在去除杂质、药液澄清度及稳定性和有效成分保留率方面具有明显的优势[4]。因此，研究絮凝纯化工艺的重要参数对中药制剂生产具有一定指导意义。

中药水提液中大部分的杂质成分含量与药液的物理参数密切相关。有研究认为，中药水提液的黏度反映了药液中淀粉、果胶、黏液质等高分子物质的含量。蛋白质和鞣质等带电胶体粒子的数量与电导率成正比[9]；药液pH 的变化可能会造成溶液中非水溶性成分转为游离沉淀，影响相关成分的存在状态[10]；浊度值是衡量水溶液中悬浮物、胶体等不溶性物质的量化指标，也是表征中药水提液澄清度的指标[11]。但是，目前研究多以1种或多种有效成分含量为药液纯化效果的评价指标[12]，而不能全面地分析药液纯化前后的变化。故本实验以提取液为研究对象，通过黏度、浊度等理化参数结合成分含量测定，系统评价不同纯化方法对其纯化效果的影响，以期为中药提取纯化建立一套新型评价模式。

在中药复方制备工艺研究中，多种检测指标的综合评价是优化工艺参数的重要方式[13]，各指标权重系数的确定是进行评价的关键[14]。采用层次分析法（AHP）赋权与客观熵权法进行综合加权，既符合中药复方君臣佐使的理论配伍规律，又体现了各指标间的实际影响，与Box-Behnken 响应面法相结合，建立复方黄芪方絮凝工艺的优化方法，为科学合理确定絮凝条件提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Thermo Ultimate 3000 型高效液相色谱仪、Ultimate 可变波长检测器（美国赛默飞科技有限公司）；e2695 型高效液相色谱仪、2424 型蒸发光散射检测器（美国Waters 公司）；RE-52AA 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；循环水式多用真空泵（上海知信实验仪器技术有限公司）；BS 110S 型电子分析天平（北京赛多利斯公司）；旋转黏度计（美国Brookfield 仪器有限公司）；PB-10 型pH 计（德国赛多利斯公司）；DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器（北京科委永兴仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品黄芪甲苷（批号：110781-201717，纯度：96.9%）、芦丁（批号：100080-201811，纯度：91.7%）均购于中国食品药品检定研究院；壳聚糖、羧甲基壳聚糖（上海源叶生物有限公司）；101 果汁澄清剂（安徽陆荣生物技术有限公司）；海藻酸钠（天津市福晨化学试剂厂）；冰醋酸（西陇化工股份有限公司）；乙腈、甲醇均为色谱级（美国Sigma 公司）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

黄芪（批号：20180909）、山楂（批号：20180510）、炒莱菔子（批号：20180415）均购于北京本草方源药业有限公司，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定符合《中华人民共和国药典》2020 年版标准。

2 方法

2.1 复方黄芪方水提液的制备与絮凝纯化处理

按参考文献［5］的工艺以处方比例称取黄芪、山楂等药味共90 g，加12 倍量水煎煮3 次，每次1 h，滤过，减压浓缩后制备复方黄芪方水提液。精密移取不同浓度水提液100 mL 于烧杯中，按照不同絮凝工艺条件进行絮凝反应，搅拌10 min 后取出，静置24 h，4000 r·min-1离心20 min（离心半径为16 cm），滤过分离上清液，备用。

2.2 絮凝剂的制备

精密称取壳聚糖1.0 g，取冰醋酸1 mL 加水定容至100 mL 量瓶中；分别精密称取羧甲基壳聚糖1.0 g、101 果汁澄清剂5.0 g、海藻酸钠0.1 g，加水定容至100 mL 量瓶中，超声混匀后静置24 h，制成相应的絮凝剂溶液。

2.3 有效成分黄芪甲苷与总黄酮保留率的测定

对絮凝后上清液中黄芪甲苷含量、总黄酮含量及絮凝处理前水提液中黄芪甲苷含量、总黄酮含量进行测定[5]，按照公式（1）计算复方黄芪方药液中黄芪甲苷、总黄酮的保留率。

2.4 不同絮凝剂的考察

2.4.1 上清液理化参数的测定 取絮凝后上清液各20 mL 于干燥至质量恒定的蒸发皿中，水浴蒸干，在105 ℃干燥至质量恒定，称质量并计算出膏率。再取絮凝后上清液各20 mL，在25 ℃下测定浊度值、电导率、pH，并于60 r·min-1转速下，测定样品黏度值。

2.4.2 絮凝剂的选择 根据相关文献及前期预实验，采用壳聚糖、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、101果汁澄清剂为絮凝剂[11,15]，絮凝条件设置为温度30 ℃、搅拌速度为400 r·min-1、2 g·L-1的絮凝剂加入量、搅拌10 min，按2.1 项下进行絮凝操作，取上清液按2.4.1 项下方法进行有效成分含量、出膏量、pH、黏度、浊度、电导率的测定与计算。

2.5 单因素考察

以药液中黄芪甲苷保留率、总黄酮保留率、上清液出膏率为指标，考察絮凝温度分别为20、30、40、50、60 ℃，药液质量浓度分别为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 g·mL-1，壳聚糖加入量分别为0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 g·L-1，搅拌速度分别为300、400、500、600、700、800 r·min-1对水提液絮凝效果的影响。

2.6 综合评分指标权重的确定

2.6.1 熵权法确定权重系数 将第i个实验的j个评价指标数据利用离差标准化方法进行数据处理，建立评价指标矩阵Xij。按公式（2）计算指标信息熵值（Hi）；按公式（3）计算各指标的客观权重系数（wj）[16]。

式中，Pij为第i个实验的j个评价指标的概率。

2.6.2 AHP法确定权重系数 根据本方中功效成分含量与絮凝工艺要求，确定各指标的优先顺序：黄芪甲苷保留率=总黄酮保留率＞出膏率，并计算得到各指标权重[17]。

2.6.3 熵权法-AHP 确定权重 按公式（4）、（5）计算复合权重系数（w复合）与综合评分[18]。

式中，Aj为AHP的权重值。

2.7 Box-Behnken响应面优化实验

选取搅拌速度（A）、壳聚糖加入量（B）、药液质量浓度（C）为3 个考察因素，根据Box-Behnken的试验设计原理，以有效成分黄芪甲苷保留率、总黄酮保留率、出膏率的综合评分为响应值，设计响应面试验[19]，因素与水平见表1。

表1 复方黄芪方水提液絮凝工艺的响应面分析因素及水平

2.8 最佳工艺验证

采用Design-Expert 11 软件分析，得到复方黄芪方水提液的最佳絮凝工艺，以优选出的工艺条件进行验证实验，平行操作3次。

3 结果与讨论

3.1 絮凝剂的选择

4 种絮凝剂对复方黄芪方水提液絮凝的影响见表2。由表2 可知，在化学指标结果中，壳聚糖的出膏率最低为30.69%，而果汁澄清剂的出膏率最高；除海藻酸钠外，其余絮凝剂的有效成分保留率均在80%以上；果汁澄清剂、壳聚糖的黄芪甲苷损失最少，其保留率分别为81.24%、78.43%。在物理指标结果中，水提液和絮凝处理后上清液的pH为4.3～4.5，说明絮凝剂在纯化过程中pH 无明显改变；未处理的水提液黏度最大，壳聚糖絮凝处理后呈现出较小黏度，其余絮凝剂絮凝后的黏度均为100～115 mPa·s；絮凝后药液浊度的顺序为壳聚糖＞羧甲基壳聚糖＞果汁澄清剂＞海藻酸钠；除壳聚糖外，絮凝后药液的电导率相较于未处理药液均有所增加。

表2 复方黄芪方不同种类絮凝剂对水提液絮凝的结果（n=2）

因此，以物理指标结合化学指标，发现壳聚糖絮凝后上清液黏度、电导率、浊度明显降低，说明纯化后澄清度好并且有效除去了药液中果胶、蛋白质、悬浮物等多种类型的杂质；并且药液的出膏率有所下降，也减少了有效成分的损失。因此，确定选用壳聚糖作为絮凝剂纯化水提液。

3.2 单因素试验结果

中药水提液的絮凝除杂过程复杂，絮凝剂与药液的结合状态对絮体的形成和纯化效果有显著影响，壳聚糖加入量、药液质量浓度、搅拌速度、絮凝温度对水提液絮凝效果的影响见图1～4。

图1 复方黄芪方壳聚糖加入量对水提液絮凝效果的影响

图1 显示，随着壳聚糖用量的增多，出膏率有所降低，这是由于壳聚糖分子氨基离子化呈正电性，将与药液中负电荷的胶粒发生中和作用[2]，随着壳聚糖用量的增多，与胶粒中和的正电荷增加导致更多的胶粒稳定性降低，进而通过絮凝反应除去更多杂质颗粒；当絮凝剂加入量＞3 g·L-1时，黄芪甲苷与总黄酮的损失明显增加。因此，初步确定3 g·L-1的壳聚糖加入量为宜。

由图2可知，药液质量浓度为0.10～1.00 g·mL-1时，各指标随药液质量浓度的增加均有不同程度的下降，这一趋势的主要原因可能是提取液质量浓度越低，杂质颗粒越分散，与絮凝剂结合也更充分，除杂效果较好。但稀释质量浓度至0.05 g·mL-1时，颗粒之间距离过大，絮凝剂与其碰撞概率下降，吸附架桥作用减弱，从而导致出膏率偏高。因此，药液质量浓度为0.10～0.25 g·mL-1适宜。

图2 复方黄芪方药液质量浓度对水提液絮凝效果的影响

由图3 可知，搅拌速度对黄芪甲苷与总黄酮保留率的影响较大，这可能是由于搅拌可以增加水提液与絮凝剂的动能，使壳聚糖分子的分散度及壳聚糖与药液之间的接触增加，从而产生较大的絮体，但是同时也产生了一定的剪切力，可能使结合物再次分离并悬浮在溶液中，进而影响整体絮凝效果。当搅拌速度＞600 r·min-1时，黄芪甲苷保留率大幅下降，因此，搅拌速度不宜＞600 r·min-1。

图3 复方黄芪方搅拌速度对水提液絮凝效果的影响

由图4 可知，20～40 ℃对絮凝效果影响并不明显，但随着絮凝温度升高到50 ℃时有效成分黄芪甲苷的损失较大。因此，在20～30 ℃下进行纯化即可。

图4 复方黄芪方絮凝温度对水提液絮凝效果的影响

3.3 复合权重结果

本实验将AHP 和熵权法得到黄芪甲苷保留率、总黄酮保留率、出膏率3 个指标的权重系数进行综合加权，计算得到各指标的wj，分别为黄芪甲苷保留率0.25、总黄酮保留率0.34、出膏率0.41；主观权重值（Aj）结果见表3。按照2.6.3 项下方法计算各指标的复合权重系数，分别为黄芪甲苷保留率（w1）0.34、总黄酮保留率（w2）0.47、出膏率（w3）0.19。

表3 AHP的指标成对比较的判断矩阵结果

3.4 响应面试验结果

响应面试验方案及结果见表4，复方黄芪方水提液絮凝效果响应面模型方差分析结果见表5，三因素间响应面交互作用见图5。

表5 复方黄芪方水提液絮凝工艺响应面方差分析结果

图5 复方黄芪方搅拌速度、壳聚糖加入量和药液质量浓度间相互作用3D图

采用Design-Expert 11 软件对表4 数据进行二次多元回归拟合，得到出膏率、黄芪甲苷保留率、总黄酮保留率的综合评分（Y）对A、B、C 的回归方程：Y=-127.76+0.42A+40.36B+330.24C +0.011AB-0.29AC+2.85BC-0.000 46A2-5.85B2-617.47C2（r=0.918 8）。由表5 可见，回归模型是显著的（P=0.004 5＜0.01），可用于响应值预测；失拟项差异无统计学意义，表明此二次回归方程拟合度良好。各因素对絮凝过程的影响程度依次为B＞A＞C；其中B 差异有统计学意义（P＜0.01）；A、C、B2、C2差异具有统计学意义（P＜0.01），表明此3 个因素对水提液的絮凝纯化工艺均有影响。

观察响应面图的坡度，可以直观判断2 个自变量对响应值的交互作用程度，即坡度越陡，说明自变量的影响越大。从图5 可以看出，B 与A、C 的交互作用明显，而A 与C 两者交互效应相对不明显。此外，3 个影响因素对絮凝效果综合评分的影响均有先增大后减小的趋势，推测可能由于壳聚糖加入量的增加及搅拌速度的加快，使壳聚糖与药液接触更加充分，絮凝反应的发生明显增加，但过量壳聚糖则不利于絮凝反应发生，而且搅拌速度过快会导致形成的絮体破碎；随着药液质量浓度增加，溶液变浓稠，进而影响了杂质颗粒的运动以及絮体的积聚。

3.5 最佳工艺验证

通过Box-Behnken设计模型的最优条件分析，得出絮凝纯化工艺参数：A 361.81 r·min-1、B 4.16 g·L-1、C 0.20 g·mL-1。考虑到实际操作，调整絮凝纯化工艺条件为A 360 r·min-1、B 4.00 g·L-1、C 0.20 g·mL-1，综合评分预测值为68.22。在此条件下，验证结果见表6，综合评分分别为70.93、72.41、71.89，与预测值的相对误差为1.86%，表明模型的预测性好，说明响应面法优化的壳聚糖絮凝工艺参数稳定可行。

表6 复方黄芪方水提液最佳絮凝工艺验证结果

4 结论

本研究利用单因素分析、熵权-AHP结合响应面法建立复方黄芪方水提液的絮凝工艺，最佳纯化水提液的絮凝工艺参数：搅拌速度360 r·min-1、絮凝剂加入量4.00 g·L-1、药液质量浓度0.20 g·mL-1。纯化得到的复方黄芪方药液澄清度好、黄芪甲苷保留率为（85.86±1.40）%、总黄酮保留率为（71.52±0.82）%、出膏率为（29.16±0.25）%。相比纯化前出膏率明显降低，并且有效保留了水提液中的有效成分，可为絮凝工艺的方法研究提供参考。

本实验首次以有效成分保留率、出膏率为化学指标，pH、黏度、浊度、电导率为物理指标，对不同絮凝剂的絮凝除杂效果进行全面比较，筛选出壳聚糖为合适的絮凝剂，并对其絮凝餐参数进行优化。此外，壳聚糖属于天然来源的高分子絮凝剂，具有无毒、可生物降解的特点[20]，可为进一步研究环境友好型材料与技术在中药纯化领域的应用提供参考。