不同干燥方法对苦地丁药材品质的影响△

王圆圆，李超，谷巍，巢建国*，毛春芳，王凯，惠西珂

1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210000；2.济川药业集团有限公司，江苏 泰兴 225400；3.江苏省南通卫生高等职业技术学校，江苏 南通 226000

苦地丁为罂粟科紫堇属植物地丁草Corydalis bungeanaTurcz.的干燥全草[1]，始载于《中药志》，别名地丁[2]，味苦，性寒，具有清热解毒、散结消肿的功效[1]，可用于治疗流行性感冒、上呼吸道感染、扁桃体炎、肺炎等[3]。近年来，河北安国苦地丁的种植面积不断扩大，产地初加工方式影响药材品质的问题日益突出。干燥是药材加工的第一步，也是保障中药材品质的重要环节。经过干燥后的药材不易腐败变质。中药成分及其药理活性复杂，不同的干燥方法会导致成分发生变化[4-5]。传统的晒干法成本低但受光照、温度、湿度等外界因素影响较大。阴干法时间较长、容易生霉，导致苦地丁药材品质下降。因此，有必要开展苦地丁药材干燥方法的研究。本研究以新鲜地丁草为原材料，对晒干、阴干、真空干燥、微波干燥、鼓风干燥5 种干燥方式进行研究。

据文献报道，苦地丁含有生物碱类、黄酮类、糖类、氨基酸等化学成分[6]，前人多采用高效液相色谱法对苦地丁生物碱类成分进行分析[7]，很难对药材品质进行综合评价。为了高效快速鉴定苦地丁的化学成分，本研究采用高效液相色谱-三重四极杆飞行时间质谱法（HPLC-Triple-TOF-MS/MS）对苦地丁成分定性分析，找出差异化学成分，通过主成分分析及聚类分析对不同干燥方法的苦地丁药材相对含量进行综合分析，结合干燥时间及能耗找出适宜的干燥方法，为苦地丁药材科学生产提供数据参考。

1 材料

1260 型高效液相色谱仪、G6500 系列四极杆-飞行时间质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；ME36S 型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ-500B 型超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水制备仪（美国Millipore 公司）；Pmb53 型快速水分测定仪（德国Adam 公司）；Q-500B型高速多功能粉碎机（上海冰都电器有限公司）；DHG-9023A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；2012 型高速台式离心机（大龙兴创实验仪器北京有限公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；COWB-4型工业微波炉（江阴辰欧微波能系统设备有限公司）。

甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯（德国默克公司）；实验用水为超纯水。

地丁草于2020 年5 月7 日采自河北省安国市段村乡，经南京中医药大学巢建国教授鉴定为地丁草Corydalis bungeanaTurcz.全草。

2 方法

2.1 样品干燥

取地丁草鲜品，混合均匀，随机分成11 份，每份约1 kg，按表1 所示加工方法进行干燥，当含水率达到13.0%时，停止干燥并留样。

表1 苦地丁干燥样品信息

2.2 色谱条件

安捷伦ZORBAX Extend-C18RRHT 色谱柱（50 mm×2.01 mm，1.8 μm）；以0.1% 甲酸水（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0～3 min，2%B；3～4 min，2%～5%B；4～7 min，5%～13%B；7～27 min，13%～30%B；27～61 min，30%～90%B；61～63 min，90%B）；流速为0.3 mL·min-1；柱温为40 ℃；进样量为3 μL；样品室温度为8 ℃。

2.3 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），在正离子模式下进行分析，干燥气温度为325 ℃；雾化器压力为35 psi（1 psi=6.895 kPa）；毛细管出口电压为110 V；干燥器体积流量为8 L·min-1；毛细管电压为4000 V；质量扫描范围m/z50～2000；仪器扫描模式为4 GHz、高分辨模式。通过Agilent MassHunter LC/MS Data acquisition B.5.01 软件同时采集样品的轮廓图和柱状图数据，数据采集前使用Agilent ESI-L 调谐液对仪器进行调谐和质量轴校正。

2.4 供试品溶液的制备

精密称定样品粉末1 g（过三号筛），置于50 mL具塞锥形瓶中，加入70%甲醇30 mL，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）60 min，冷却，70%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，以12 000 r·min-1（离心半径为5.8 cm）离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.5 质量控制（QC）样品的制备

取2.4 项下的所有供试品溶液各1 mL 混合均匀，作为QC 样品，按2.2 和2.3 项下条件，在所有样品数据采集前和采集后及每3 个样品数据之间各进行1次QC样品的数据采集。

2.6 数据分析

每个样品平行分析2 次后，使用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.06.00 软件查看QC 样品的数据，查看保留时间及响应值的变化；采用MS-DIAL ver 4.18 软件对实验数据进行处理获得解卷积谱图，通过数据库匹配作为化合物鉴定的先决条件，用MS-FINDER ver 3.44 通过其元素分子式和电离质谱碎片来注释未知化合物，使用SPSS 20.0、MetaboAnalyst 5.0 对样品数据进行主成分及聚类分析。

3 结果

3.1 定性结果分析

按照上述液相色谱和质谱条件对苦地丁样品进行分析，由于基峰离子流图（BPC）在正离子模式下色谱峰比较丰富（图1），本研究采用正离子的全扫描检测模式对不同干燥方法苦地丁的化学成分进行定性分析。每种干燥方法的苦地丁药材均鉴定到了37 个化合物，包括生物碱类成分24 个（1～24）、黄酮类成分2 个（25～26）、氨基酸类成分11 个（27～37），鉴定化合物的相关信息见表2。

图1 苦地丁药材样品离子流图

表2 苦地丁化学成分鉴定结果

续表2

3.2 聚类分析

聚类分析是将样品按照其数据指标的相似度逐渐聚合在一起，从而使类间差异最大，而类内差异最小[21]。用MetaboAnalyst 4.0 软件对不同干燥方法的苦地丁中共有的37 个成分的相对峰面积进行归一化处理后得热图（Heatmap，图2）。

由图2 可以看出，不同干燥方法的苦地丁样品分为2 类：1、3、4、6、9、10 号样品聚为一类，说明这6 个样品之间的相似性较高；其余样品聚为一类。Heatmap 上的每个彩色单元格代表不同化学成分的相对含量，红色越深，相对含量越高；颜色越深，含量越低。11 种不同干燥方法的苦地丁样品的生物碱类成分含量均高于黄酮、氨基酸类。

图2 不同干燥方式苦地丁药材Heatmap

3.3 主成分分析

主成分分析是一种采用降维思想的多元统计方法，用于考察多个变量间的相关性。通过少数几个主成分来揭示多个变量间的内部结构，即从原始变量中导出少数几个主成分，使其尽可能多地保留原始变量的信息，且彼此间互不相关。主成分分析法通过综合多指标评价不同干燥方法苦地丁药材的品质，克服了仅依靠单一变量评价药材品质的局限性，评价结果准确可靠[21]。

采用SPSS 20.0 统计软件将11 批样品中37 个成分的相对含量结果组成矩阵，数据经标准化处理后进行主成分分析，主成分分析中特征值及方差贡献率见表3。由表3 可知，前7 个主成分的特征值均大于1，表明前7 个主成分在苦地丁药材质量评价中起主导作用，7 个主成分的累积方差贡献率达94.871%（＞85%），能较客观地反映不同干燥方式苦地丁药材的综合质量，故选取前7 个主成分进行分析。

表3 苦地丁药材中各成分旋转后的主成分特征值及贡献率

主成分是原始变量的两两不相关且具有最大方差的线性组合。原始变量对主成分的影响用载荷表示，载荷绝对值越大，影响越大[21]。从表3～4可以看出，第一主成分的方差贡献率为16.554%，小檗碱、L-谷氨酸的因子载荷值较大，说明第一主成分主要反映此类信息；第二主成分的方差贡献率为16.288%，反映了oxocorynolineisomer、γ-glutamylvaline 的信息；第三主成分的方差贡献率为15.703%，反映了波尔定碱、延胡索碱甲、spallidamine 的信息；第四主成分的方差贡献率为15.664%，反映了罂粟碱、L-酪氨酸的信息；第五主成分的方差贡献率为14.929%，反映了芦丁、L-脯氨酸、天冬氨酸的信息；第六主成分的方差贡献率为8.46%，反映了比枯枯灵、原阿片碱、紫堇灵的信息；第七主成分的方差贡献率为7.273%，反映了noscapine、血根碱的信息。这7个主成分基本包含了大部分成分的信息。

表4 苦地丁药材中各成分旋转变换后的因子载荷矩阵

不同干燥方式的苦地丁样品的主成分各因子总得分见表5，根据各主要因子的权重系数计算得出各样品的综合得分。权重系数依据主成分的方差贡献率与8 个主成分的总方差贡献率之比，主成分1 的权重为0.174 5，同理可得主成分2～8的权重分别为0.171 7、0.165 5、0.165 1、0.157 4、0.089 2、0.076 7。各主成分因子得分与其权重乘积之和相加得出各苦地丁样品的总因子得分（F），其表达式为F=0.174 5F1+0.171 7F2+0.165 5F3+0.165 1F4+0.157 4F5+0.089 2F6+0.076 7F7，F值 越高，综合质量越好[21]。

表5 不同干燥方式苦地丁药材的主成分因子及品质综合评价

3.4 苦地丁不同干燥方法的时间、能耗

苦地丁不同干燥方法耗能不同，由表6 可以看出，鼓风干燥耗能＞真空干燥＞微波干燥，但由于晒干法与阴干法耗时久，受环境影响较大，如遇梅雨天气，易出现霉变等现象。

表6 不同干燥方式苦地丁药材的耗时耗能

4 讨论

本研究发现，不同干燥方法的苦地丁药材质脆，叶多皱缩，外观差异不大，颜色有一定差异，如晒干的苦地丁药材为黄绿色，阴干、真空干燥为暗绿色，微波干燥及鼓风干燥均为淡黄绿色。前期已验证不同干燥方法的苦地丁药材中紫堇灵的质量分数均≥0.14%，符合《中华人民共和国药典》2020年版标准，因此，本研究选取了晒干、阴干、微波干燥、鼓风干燥、真空干燥5 种干燥方法，分别设置不同的温度进行实验，采用非靶向的HPLC-Triple-TOFMS/MS 代谢组学分析技术得到准分子离子及碎片离子的元素组成等结构信息，结合文献提供的数据鉴定化合物，同时QC 也为实验的准确性提供了一定的依据。

苦地丁化学成分丰富，本研究通过HPLCTriple-TOF-MS/MS 技术对不同干燥方法的苦地丁药材进行鉴定，共鉴定出37 个差异化学成分，包括生物碱类、黄酮类、氨基酸类，其中生物碱类具有抗炎、镇痛、抗菌等多种生物学特性[6]；黄酮类化合物是天然抗氧剂，具有抗氧化和清除自由基的作用；氨基酸类化合物是参与生命活动的小分子物质，具有免疫调节和抗肿瘤等作用[22]。文献报道，不同干燥温度对化学成分产生一定的影响，如鼓风干燥法是目前中药材常用的干燥方法，其温度是影响药材品质的重要因素，温度过高或时间过长会使药物部分成分分解[22]。微波干燥法不适合氨基酸等热敏类化学成分[4]。研究结果显示，采用鼓风干燥法与真空干燥法干燥的苦地丁药材氨基酸类成分的相对含量均高于微波干燥法。真空干燥法是使药材处于负压状态，可以避免化学成分发生氧化；传统的晒干、阴干法受外界因素影响较大。37 个化学成分的主成分结果显示，晒干、真空50 ℃、鼓风50 ℃干燥的苦地丁药材品质优于其他干燥方法。

干燥时间及能耗也是产地加工时需要考虑的因素，微波干燥速度较快，耗能较少；真空干燥耗时长，耗能多；传统的晒干和阴干法对场地、环境的要求较高，干燥时间受环境因素影响大。综上所述，在考虑苦地丁产地初加工时，可综合考虑晒干法和鼓风50 ℃干燥法。