忍冬属药材川银花与金银花 山银花的鉴别研究△

索彩仙，程学仁，潘礼业，邱韵静，吴文平，李国卫

广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的花蕾或初开的花[1]；山银花为灰毡毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.、红腺忍冬L.hypoglaucaMiq.、华南忍冬L.confusaDC.或黄褐毛忍冬L.fulvoto-mentosaHsu et S.C.Cheng 的花蕾或带初开的花[1]；川银花为淡红忍冬L.acuminataWall.的干燥花蕾或带初开的花，习称“肚子银花”或“沐川银花”，是四川主流川银花品种之一[2]。三者均具有清热解毒、保肝、抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[3-5]。“忍冬”一名始载于《名医别录》，后《新修本草》《证类本草》均有收录[6]，全世界忍冬属药材有200 余种，我国有98 种，其中以西南各省种类居多[7]，药材名称较为混乱，经常出现同名异物的现象[8]。忍冬药材除《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版中规定的5种忍冬外，还有很多地方习用品。川银花一直作为四川地方习用品使用，其药用资源丰富。目前市面上以金银花和山银花（灰毡毛忍冬）作为主流产品流通，且易混淆，对金银花与山银花的鉴别研究较多，但以川银花为主要研究对象并同时对忍冬属其他基原进行鉴别比较的研究较少[9]。为提高地方习用品的资源开发利用，丰富忍冬属药材不同基原的鉴别研究内容，本研究利用性状和显微鉴别研究川银花（淡红忍冬）、金银花（忍冬）和山银花（灰毡毛忍冬）三者的药材特征差异，通过建立3 种药材的超高效液相色谱法（UPLC）指纹图谱，结合系统聚类分析和主成分分析，比较3 种忍冬属药材的差异，为忍冬属药材资源的可持续利用和进一步研究提供参考，也为地方习用品川银花的资源开发利用提供数据支持。

1 材料

Waters H-Class 型超高效液相色谱仪；Waters BEH Phenyl型色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；XP-26型百万分之一天平、ME204E型万分之一天平（瑞士Mettler公司）；Milli-Q 超纯水净化系统（美国Millipore 公司）；KQ-500DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ICC50W 型光学显微镜（LETCA 公司）；甲醇、乙腈为色谱纯（Merk 公司）；水为Milli-Q纯化水；其余试剂为分析纯。

对照品绿原酸（批号：110753-201817，纯度：96.8%）、马钱苷（批号：111640-201808，纯度：99%）、木犀草苷（批号：111720-201609，纯度：94.9%）由中国食品药品检定研究院提供；对照品异绿原酸A（批号：wkq18041207）、异绿原酸B（批号：wkq17060705）、异绿原酸C（批号：wkq18050905）、隐绿原酸（批号：wkq16081903）、新绿原酸（批号：wkq16050805）、獐牙菜苷（批号：wqk17092203）由四川省维克奇生物科技有限公司提供，纯度均为98%；实验所用药材经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定，川银花为D1～D12 号样品，是忍冬科植物淡红忍冬Lonicera acuminataWall.的干燥花蕾或带初开的花[2]；金银花为J1～J12 号样品，是忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花[1]；山银花为H1～H12 号样品，是忍冬科植物灰毡毛忍冬[1]L.macranthoidesHand.-Mazz.的干燥花蕾或带初开的花，见表1。

表1 川银花、金银花、山银花药材信息来源

2 方法与结果

2.1 性状鉴别研究

对36 批药材的花蕾颜色和形态进行鉴别研究，结果均符合《四川省中药材标准》2010 年版及《中国药典》2020年版标准（表2）。

表2 川银花、金银花、山银花药材性状鉴别

2.2 光学显微鉴别研究

采用ICC50W 型光学显微镜对已处理的药材进行显微鉴别。鉴别要点：川银花（淡红忍冬）中未见腺毛；金银花（忍冬）中可见极多头部倒圆锥形、类圆形腺毛以及外壁表面疱状突起厚壁非腺毛；山银花（灰毡毛忍冬）中可见较多花粉粒，呈类三角形，外壁表面具细密短剌，具3 个孔沟（表3、图1～3）。

表3 川银花、金银花、山银花药材光学显微鉴别

图1 川银花（淡红忍冬）药材显微鉴别

图2 金银花（忍冬）药材显微鉴别

图3 山银花（灰毡毛忍冬）药材显微鉴别

2.3 指纹图谱及化学计量学分析

2.3.1 色谱条件 采用Waters BEH Phenyl色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～1 min，4%～5%A；1～9 min，5%～6%A；9～13 min，6%～10%A；13～15 min，10%～14%A；15～30 min，14%～25%A），流速为0.3 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为240 nm；进样量为1 μL。

2.3.2 对照品溶液制备 取对照品绿原酸、木犀草苷、马钱苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、隐绿原酸、新绿原酸、獐牙菜苷适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为45.631、87.833、84.233、250.390、176.302、223.832、156.898、191.296、191.982 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备 取本品粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，超声处理（功率：300 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，用70%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 方法学考察

2.3.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液（D2），按2.3.1项下色谱条件连续进样6次，以绿原酸为参照峰，计算11 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD＜2%，表明仪器精密度良好。

2.3.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液（D2），按2.3.1项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，以绿原酸为参照峰，计算11 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD＜2%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.4.3 重复性试验 取样品粉末约0.5 g，平行6 份，按2.3.3 项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件测定，以绿原酸为参照峰，计算11 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD＜2%，表明该方法重复性良好。

2.3.4.4 样品测定 取36批样品，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，分别记录UPLC指纹图谱。

2.3.5 指纹图谱分析及评价

2.3.5.1 共有峰及化学成分归属 采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012A版对36 批药材UPLC 指纹图谱进行结果分析，12 批川银花样品共确定11个共有峰（图4），12批金银花样品共确定14个共有峰（图5），12批山银花样品共确定8 个共有峰（图6）。川银花、金银花和山银花三者共有峰为8个，2号峰（绿原酸）分离度好，峰形对称，为药材中清热、抗菌、抗病毒的主要成分之一，故以2 号峰（绿原酸）为参照峰（S 峰）。通过各对照品保留时间和紫外吸收光谱对共有峰的化学成分进行归属，峰1 为新绿原酸，峰2（S）为绿原酸，峰4 为隐绿原酸，峰7 为马钱苷，峰8 为獐牙菜苷，峰10为木犀草苷，峰11为异绿原酸B，峰12为异绿原酸A，峰14为异绿原酸C（图7）。

图4 12批川银花UPLC指纹图谱

图5 12批金银花UPLC指纹图谱

图6 12批山银花UPLC指纹图谱

图7 忍冬属3种药材共有峰对照品归属

2.3.5.2 川银花与金银花、山银花共有峰比较 以3种药材在UPLC 指纹图谱中共有峰的数目差异作为忍冬属药材品种鉴定的依据。如表4 所示，以峰1～5、7、9、11～14 作为川银花指纹图谱的特征峰，与金银花比较，川银花中未含有峰6、8、10，以这3个峰作为川银花与金银花的鉴别成分；对比山银花的8 个共有峰，川银花增加峰5、7、13，以这3 个峰作为川银花与山银花的鉴别成分；金银花与山银花差异更为明显，峰5～8、10、13 均是山银花药材中未含有成分。

表4 忍冬属3种药材UPLC指纹图谱共有峰信息比较

2.3.5.3 相似度评价 采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012 版分别对D1～D12、J1～J12、H1～H12 共36 批药材UPLC 指纹图谱进行数据处理，以峰2（绿原酸）为参照峰，采用平均数，时间窗口为1，自动匹配，计算相似度系数，12 批川银花药材相似度均在1.00，样品相似度最高，12 批金银花药材的相似度在0.99 以上，12批山银花药材的相似度在0.98～0.99，见表5。

表5 忍冬属3种药材样品相似度评价结果

2.3.5.4 相似度比较 指纹图谱结果显示，川银花与金银花和山银花共有峰个数分别为11、14、8 个，三者共有峰有8个。分别将3种药材对照图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012A版，进行两两相似度比较，其中川银花和金银花相似度为0.88（图8），川银花和山银花相似度为0.97（图9），金银花和山银花相似度为0.87（图10）。实验数据表明，川银花和金银花、山银花的指纹图谱共有峰信息和相似度均有差异，说明同属药材化学成分亦存在差异。

图8 川银花和金银花UPLC指纹图谱

图9 川银花和山银花UPLC指纹图谱

图10 金银花和山银花UPLC指纹图谱

2.3.6 聚类分类 将36 批药材样品共有峰各色谱峰峰面积除以称样量后，运用SPSS 20.0 软件对其进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以平方Euclidean 距离作为样品相似度的距离公式，得到样品聚为3 类（图11）。D1～D12 为川银花聚为一类，J1～J12为金银花聚为一类，H1～H12为山银花，其中H7 号样品未能与其他样品聚在一类。聚类结果说明不同品种间的药材存在一定差异。

图11 忍冬属药材样品聚类分析

2.3.7 主成分分析（PCA）以36批药材UPLC 指纹图谱8个共有峰峰面积进行PCA，结果显示，前2个主成分的累积方差贡献率达88.101%，确定主成分数为2（表6）。根据因子载荷矩阵得知，峰2、4、11、12、14在第1主成分上有较高载荷，5个峰均为酚酸类成分，依次是绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C，说明酚酸类成分对主成分1 产生主要影响；峰9 则对主成分2 产生主要影响（表7）。由得分值数据可知，川银花主成分1 均为正值，主成分2 为负值，与山银花的差异主要体现在主成分2，山银花的主成分2几乎为正值，两者主成分评分值存在差异，可实现样品分离；金银花2 个主成分评分均为负值，与川银花差异更为明显（表8）。以主成分为变量得到36 批药材得分图，由得分图可见，PCA 将36 批药材分为3 类，即第Ⅰ类川银花，第Ⅱ类金银花，第Ⅲ类山银花。结果显示，3 种药材得到明显区分，且同基原样品较好地聚集在一起，除第Ⅲ类中，H7 号样品单独聚在一类，与聚类分析结果一致（图12）。

图12 忍冬属3种药材成分主成分得分

表6 忍冬属3种药材PCA特征值及各主成分的贡献率

表7 忍冬属3种药材主成分分析因子载荷矩阵

表8 36批忍冬属药材样品综合得分结果

3 分析与讨论

3.1 性状及显微结果分析

川银花（淡红忍冬）花蕾呈短棒状，疏被毛；金银花（忍冬）花蕾呈棒槌形，上粗下细，密被短绒毛；山银花（灰毡毛忍冬）花蕾呈棒状稍弯曲，无毛。花蕾颜色上除川银花（淡红忍冬）为棕褐色外，其余2 种多为淡黄绿色和黄绿色。光学显微结果显示，未在川银花（淡红忍冬）中发现腺毛，常见厚壁非腺毛，薄壁非腺毛以及草酸钙簇晶较为少见；金银花（忍冬）中有2 种腺毛，分别是头部倒圆锥形及头部类圆形，这与《中药显微鉴定图典》中金银花项下的显微鉴别一致[10]；山银花（灰毡毛忍冬）中腺毛较少，其头部多数为圆盘形，常见厚壁非腺毛和花粉粒。以三者的共有种类非腺毛、草酸钙簇晶和花粉粒为鉴别点进行比较，金银花（忍冬）的厚壁非腺毛最长，其次是川银花（淡红忍冬），最后为山银花（灰毡毛忍冬），其中山银花（灰毡毛忍冬）基部似三角状，而金银花（忍冬）较为平坦，草酸钙簇晶和花粉粒未见有明显差异，实验通过性状和显微鉴别研究对其进行初步的判别。

3.2 指纹图谱结果分析

通过对照品保留时间和紫外吸收光谱共指认了9个色谱峰，其中6个为酚酸类成分，说明药材中主要为酚酸类化学成分，具有清热、抗菌、抗病毒、抗炎等功效[11-13]。本实验研究建立同一个UPLC 指纹图谱方法，对川银花和金银花、山银花进行快速鉴别区分，通过3 者共有峰数目差异进行分析，峰6、8、10 可作为川银花和金银花的鉴别区分，峰5、7、13 作为山银花和川银花的鉴别区分，峰1～5、7、9、11～14作为川银花UPLC指纹图谱的特征峰。相似度比较结果显示，与种内药材比较，不同种间药材相似度较低，其中以川银花和山银花相似度最高为0.97，最低为0.87。结合指纹图谱和相似度结果分析，说明不同种间药材在化学成分上存在差异。

3.3 聚类及主成分结果分析

聚类分析结果显示，36 批药材样品分为3 类，表明同基原药材具有高度相似度，不同种的药材具有明显差异。文献报道，绿原酸在酸性pH条件下十分稳定，但在中性和碱性pH及在加热情况下，容易生成新绿原酸和隐绿原酸[14]。聚类分析和主成分得分图结果显示，H7号样品被单独分在一类，12批样品中，H7号样品绿原酸峰面积为新绿原酸33倍，为隐绿原酸22 倍，与剩余11 批样品比较，H7 号样品绿原酸和新绿原酸峰面积比值差异最大，绿原酸和隐绿原酸峰面积比值则相差不大，分析H7号样品分类和排名与新绿原酸有关，推测为绿原酸受热分解不够，影响新绿原酸的转化，导致H7号样品单独分在一类。采取系统聚类分析首先可以判定品种的分类，为不同种间样品差异提供化学计量分析。应用PCA，筛选出共有的特征性成分，本次得到两大主成分，主成分1 主要为峰2、4、11、12、14 对整体的方差贡献率较高，说明这5 个成分为川银花、金银花、山银花的主要成分群组，而峰9 则为另一成分组。通过2个主成分得分值的比较得知，主成分1中，川银花得分值均为正值，得分最高，主成分2中山银花为最大值，而金银花在2 个主成分中均为最低值。此外，3 者的峰面积差异显著，川银花中隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C峰面积为最大值，与主成分1 得分值为正值结果一致，说明3 种药材中，川银花的酚酸类成分占比最大；川银花和山银花的差异主要体现在主成分2，川银花为得分负值，山银花则为正值，且载荷较高的峰9峰面积仅为山银花的一半，得分值与峰面积相匹配；金银花不仅2个主成分得分值几乎为负值，而且峰面积也是最低值，得分值和峰面积与川银花差异明显。数据分析结果显示，不同种间药材成分存在差异。

本研究对川银花、金银花和山银花药材进行性状和显微鉴别研究，结果发现，3 种药材的鉴别特征存在差异，建立的UPLC 指纹图谱方法可以将川银花与金银花和山银花药材进行鉴别，利用系统聚类分析和PCA 对36 批药材进行分析，结果显示，3种忍冬药材存在成分差异，实验结果为忍冬属药材的进一步研究提供了一定的依据。