基于网络药理学的地龙平喘作用机制研究△

马韫楠，吴娅丽，钟宛凌，汪文杰，杨万青，张经纬，李鹏跃，杜守颖

北京中医药大学，北京 102488

地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）、通俗环毛蚓P.vulgarisChen、威廉环毛蚓P.guillelmi（Michaelsen）或栉盲环毛蚓P.pectiniferaMkhaeken的干燥体[1]。地龙始载于《神农百草经》，性寒，味咸，归肝、脾、膀胱经，具有清热止痉、平肝熄风、通经活络、平喘利尿等功效。现代研究表明，地龙主要含有氨基酸、蛋白质和多肽、脂肪酸、核苷酸等成分，具有平喘、降压、抗凝血、解热镇痛等药理作用[2-3]。

支气管哮喘简称哮喘，是由嗜酸粒细胞、肥大细胞、T 淋巴细胞、中性粒细胞等多种气道炎性细胞，气道上皮细胞、平滑肌细胞等结构细胞及细胞组分参与的气道慢性炎症疾病[4]。哮喘诱因较多，患者常出现可逆性气流受限，并引起反复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等。目前临床治疗哮喘常用的药物有抗胆碱能药物、吸入型糖皮质激素、β2-受体激动剂、磷酸二酯酶抑制剂等[5]，但尚无法彻底治愈。哮喘属于中医学“哮病”范畴，基础证候可分为外寒证、痰饮证、痰热证、肾气虚证等[4]。地龙是中医临床治疗热哮证哮喘的常用药，其组方广泛应用于小儿哮喘、咳嗽变异性哮喘、顽固性哮喘等疾病[6-9]。据统计，地龙在中国知网（CNKI）、万方、维普、中国生物医学文献数据库1988—2018 年治疗哮喘有确切疗效的1132 条方剂研究中出现470 次，频次仅次于麻黄、甘草和苦杏仁[10]。地龙提取物已被证明对动物哮喘模型、离体支气管平滑肌诱导收缩模型和炎症细胞模型具有干预作用[11-12]，但其发挥药效的物质基础和作用机制尚不明确。

网络药理学融合了系统生物学、多向药理学和计算机分析等多种技术，通过构建疾病-靶点-成分等相互作用网络，能够整体性、系统性、多层次地阐明药物的作用机制，符合中药多成分、多靶点、多途径作用的特点，已成为中医药领域重要的研究方法[13]。本研究采用网络药理学结合动物实验的方法，基于文献调研结果和多种数据库分析获得了地龙化学成分干预哮喘的靶点和信号通路，构建了成分-靶点-通路相互作用网络，综合网络分析和基因富集分析结果，对地龙平喘的物质基础和作用机制进行了合理的推测，并采用豚鼠离体气管平滑肌诱导收缩模型验证了地龙提取物对胆碱能受体兴奋导致的气管平滑肌收缩的抑制作用，为地龙的药理学研究提供参考。

1 材料

1.1 实验动物

Hartley品系健康豚鼠，体质量300～350 g，由北京隆安实验动物养殖中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0006。所有操作均符合北京中医药大学动物管理委员会相关伦理学要求（审批编号：2020102703）。

1.2 试药

沪地龙药材由云南永安制药有限公司提供（批号：2020051101），经北京中医药大学杜守颖教授鉴定为通俗环毛蚓Pheretima vulgarisChen 的干燥体；盐酸毛果芸香碱（纯度≥98%，批号：B28193）、氨茶碱（纯度≥98%，批号：B24219）购于上海源叶生物科技有限公司；克-亨氏液为自制（取NaCl 6.9 g、KCl 0.35 g、KH2PO40.16 g、NaHCO32.1 g、CaCl20.28 g、葡萄糖2 g，超纯水溶解至1 L，pH为7.4）。

1.3 仪器

JZJ01 型张力换能器、RM6240B 型多道生理信号采集处理系统（成都仪器厂）；ZRX-28952型麦氏浴槽（北京中瑞祥科技有限公司）。

2 方法

2.1 地龙化学成分的筛选和靶点预测

通过检索CNKI（https://www.cnki.net/）、百链数据库（http://www.blyun.com/）和PubMed 数据库（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）中地龙化学成分研究的相关文献[14-18]，收集地龙的化学成分，利用ChemDraw 软件绘制各化合物的分子结构并保存为sdf（*.sdf）格式文件。

将地龙化学成分的sdf 格式文件上传至SwissADME 平 台（http://www.swissadme.ch/）[19]，筛选Pharmacokinetics 项下肠胃吸收（GI absorption）结果为“High”，并且Druglikeness 项下5 种类药性预测（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）结果中有2 个及2 个以上为“Yes”的化合物作为具有较好口服生物利用度和类药性的活性化合物。将活性化合物sdf 格式文件上传至SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平台[20]，物种选择“Homo Sapiens”，以probability＞0为筛选条件，对化合物的潜在靶点进行预测，建立地龙活性成分-靶点数据库。

2.2 哮喘疾病相关靶点预测

以“Asthma”“Bronchial Asthma”“Cough-Variant Asthma”为关键词，检索OMIM（https://omim.org/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）数据库，将所收集的基因靶点去冗余，即为哮喘相关靶点。利用Cytoscape 3.7.1软件进行可视化处理。

2.3 地龙平喘作用靶点的筛选

将地龙活性化合物相关靶点与哮喘相关靶点利用Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）取交集，获取地龙活性成分与哮喘疾病的共同靶点，即为地龙平喘的作用靶点。

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建及核心靶点筛选

将2.3 项下得到的交集靶点导入STRING 11.0数据库（https://version-11-0.string-db.org/），“Organism”设为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设置为“High confidence（0.700）”，构建PPI 网络。将PPI 网络的tsv 文件导入Excel 表格，利用Cytoscape 3.7.1软件进行可视化处理，用Cytohubba插件计算评分筛选核心靶点。

2.5 基因富集分析

通过Metascape 数据库（http://metascape.org/）对地龙平喘作用靶点进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。GO 分析设定阈值P＜0.05，选取生物过程（biological process，BP）中排名前20 的条目进行可视化。KEGG 分析设定阈值P＜0.05，将得到的信号通路进行可视化。根据KEGG分析结果，构建成分-靶点-通路网络。

2.6 地龙提取物对离体气管平滑肌收缩模型作用验证

2.6.1 地龙提取物制备 取地龙药材10 g，加纯水40 mL匀浆2 min，8000 r·min-1离心10 min（离心半径为13.5 cm），分离上清液作为提取物，每毫升提取物相当于地龙药材0.25 g；采用Bradford 法测定提取物的蛋白含量。

2.6.2 豚鼠离体气管平滑肌螺旋条标本的制备 豚鼠猛击头部处死后迅速取出气管，浸没于预热至37 ℃、氧气饱和的克-亨氏液中，小心剥离支气管周围组织，将其由一端向另一端剪成螺旋形条状，宽2～3 mm，长3～4 cm。将制备的螺旋条置于盛有克-亨氏液的37 ℃恒温通氧浴槽中，两端用细绳结扎，一端系于浴槽底部固定钩，另一端连接张力换能器。将生物信号采集系统与张力换能器连接，记录平滑肌张力的变化，调节标本初始负载为1.0 g，稳定40 min后开始实验。

2.6.3 地龙提取物对豚鼠离体气管平滑肌张力的影响 待离体气管平滑肌螺旋条张力稳定后，向培养液体积为22 mL 的浴槽中分别加入0.9%氯化钠溶液、药材终质量浓度为5.556 g·L-1的地龙提取物和终质量浓度为2.273 mg·L-1的毛果芸香碱溶液，观察药物对正常状态下离体气管平滑肌张力的影响并记录诱导后张力，每次诱导观察后更换浴槽内的培养液。

待离体平滑肌张力稳定后，加入终质量浓度为2.273 mg·L-1的毛果芸香碱溶液，诱导气管平滑肌收缩，平滑肌收缩张力达到稳定后分别加入地龙提取物使恒温浴槽中的地龙药材质量浓度依次为2.273、5.556、10.870 g·L-1，阳性对照组加入终质量浓度为0.114 g·L-1的茶碱和0.9%氯化钠溶液，每次加药后更换浴槽内的培养液。记录诱导收缩后平滑肌张力与给药后平滑肌张力，按照公式（1）计算舒张率。实验共重复6次。

2.6.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.3.0 软件对数据进行统计学分析。所有数据用（）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 地龙活性化合物靶点和疾病靶点预测

通过文献检索收集地龙中化合物，并通过SwissADME 平台筛选获得活性化合物71 个，包括氨基酸、脂肪酸（酯）、嘌呤和含氮化合物等其他小分子，通过SwissTargetPrediction 平台预测并收集这些化合物的靶点，去重后得到化合物潜在靶点828个。检索OMIM 和DrugBank数据库，共收集疾病相关靶点145 个。将化合物潜在靶点与疾病相关靶点经Venny 2.1网站绘制韦恩图（图1）分析后，获得2个靶点数据集的交集靶点，即地龙平喘的作用靶点67个，见表1。与共同靶点有映射关系的地龙平喘活性化合物共56个，见表2。

图1 地龙化合物潜在靶点与哮喘靶点的韦恩图

表1 地龙化合物与哮喘的共同靶点

表2 地龙潜在平喘活性成分

3.2 地龙平喘作用靶点的PPI网络分析

将地龙平喘作用靶点导入STRING 11.0数据库，查询靶点的相互作用关系，通过Cytoscape 3.7.1软件进行可视化分析，获得靶点PPI 网络，见图2。该PPI 网络节点数为58，边数为168，平均节点度值为6。通过CytoHubba 插件评估靶点蛋白质在PPI网络中的连接作用程度，选取12 种算法排名前20的靶点中出现8 次以上的靶点为PPI 网络中的核心靶点，共9 个，分别为细胞色素P450 3A4（CYP3A4）、细胞色素P450 1A1（CYP1A1）、UDP-葡萄糖醛酸转移酶2B7（UGT2B7）、前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）、前列腺素E2受体EP2 亚型（PTGER2）、细胞色素P450 2C9（CYP2C9）、细胞色素P450 2C19（CYP2C19）、β2-肾上腺素受体（ADRB2）、细胞色素P450 1A2（CYP1A2）。

图2 地龙平喘作用靶点PPI网络

3.3 GO生物功能注释和KEGG通路富集分析

GO 分析结果表明，地龙平喘作用的67 个潜在靶点能够调控40 个生物学过程，包括血液循环（blood circulation）、花生四烯酸代谢过程（arachidonic acid metabolic process）、神经递质水平调节（regulation of neurotransmitter levels）、化学突触传递（chemical synaptic transmission）、腺苷受体信号通路（adenosine receptor signaling pathway）等，选取排名前15 的条目进行可视化，见图3。该结果提示，地龙平喘活性化合物可以通过参与调控多种生物学过程而发挥作用。

图3 地龙平喘作用靶点的GO生物过程分析

KEGG 通路富集分析表明，地龙平喘作用靶点主要参与15 条信号通路的调控，包括胆碱能突触（cholinergic synapse）、神经活性配体-受体相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、环磷酸腺苷信号通路（cAMP signaling pathway）、色氨酸代谢（tryptophan metabolism）等，将结果进行可视化，见表3。

表3 地龙平喘作用靶点的KEGG通路富集分析

3.4 成分-靶点-通路网络的构建

结合地龙平喘活性化合物-靶点数据库与KEGG分析的信号通路结果，通过Cytoscape 3.7.1 软件构建成分-靶点-通路网络，见图4。该网络包含138 个节点、530 条边，其中地龙平喘活性成分56 个，作用靶点67个，信号通路15条。分析结果显示，地龙中化合物分子的平均度值为8，氨基酸、脂肪酸（酯）、核苷酸、含氮化合物等其他分子的平均度值分别为2、13、5 和7，度值最高的化合物是肉豆蔻烯酸和9-十四碳烯酸，度值均为23。

图4 地龙平喘作用的成分-靶点-通路网络

该网络中，靶点的化合物-靶点映射平均度值为6，度值最高的靶点为皮质类固醇11-β-脱氢酶同工酶1（HSD11B1），度值为22。其他度值较高的靶点还有糖皮质激素结合球蛋白（SERPINA6）、腺苷受体A3（ADORA3）、PTGER2、HSD11B2、PTGS2等。

3.5 地龙提取物对离体气管平滑肌收缩模型作用验证

3.5.1 地龙提取物制备 按2.6.1 项下方法平行制备3 批地龙提取物，通过Bradford 法测定3 批提取物的蛋白质量浓度为（1.308±0.004）mg·mL-1，RSD为0.32%，说明通过该方法制备的地龙提取物的蛋白含量较稳定。

3.5.2 地龙提取物对豚鼠离体气管平滑肌张力的影响 由实验结果可知，2.273 mg·L-1的毛果芸香碱溶液能够较好地引起豚鼠离体气管平滑肌螺旋条的收缩，使气管平滑肌张力显著上升。与0.9%氯化钠溶液对照组比较，地龙提取物5.556 g·L-1对正常状态下的离体气管平滑肌张力无明显影响。与0.9%氯化钠溶液对照组比较，阳性药氨茶碱能显著抑制毛果芸香碱诱导产生的收缩作用，使气管平滑肌张力下降；质量浓度为2.273、5.556、10.870 g·L-1的地龙提取物均能不同程度地抑制毛果芸香碱引起的气管平滑肌收缩，且舒张率与质量浓度呈正相关，见表4。0.9%氯化钠溶液、氨茶碱及不同质量浓度的地龙提取物对毛果芸香碱诱导的气管平滑肌收缩的影响见图5。

图5 不同质量浓度地龙提取物对毛果芸香碱诱导的气管平滑肌收缩的影响

表4 地龙提取物对毛果芸香碱诱导豚鼠离体气管平滑肌收缩模型的作用（,n=6）

表4 地龙提取物对毛果芸香碱诱导豚鼠离体气管平滑肌收缩模型的作用（,n=6）

注：药物对正常离体气管平滑肌的影响与0.9%氯化钠溶液对照组比较，△△△P＜0.001；药物对毛果芸香碱诱导离体气管收缩模型的影响与0.9%氯化钠溶液对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.001。

4 讨论

地龙的化学成分种类繁多，作用机制复杂。本研究构建了地龙治疗哮喘的化合物-靶点-通路网络，通过Cytoscape 3.7.1 软件对地龙活性成分的度值分析得出，脂肪酸（酯）的平均度值最高，脂肪酸类成分作用的靶点共55 个，占研究靶点总数的82.1%，并且该55 个作用靶点覆盖了KEGG 富集的15 条通路。该结果表明，地龙中脂肪酸类成分可能通过多种途径干预疾病，产生平喘作用。地龙含多种不饱和脂肪酸如α-亚麻酸等。ω-3 多不饱和脂肪酸可以通过抑制核转录因子-κB（NF-κB）活化等多种机制调控机体的炎症反应和免疫功能[21]。研究证明，急性呼吸窘迫综合征（ARDS）治疗中加用ω-3多不饱和脂肪酸可对患者机体的免疫功能和炎症反应起到一定的调节作用，并改善气体交换能力[22]。周明眉等[23]证明了地龙酸性部位可降低过敏性哮喘模型小鼠支气管灌洗液（BALF）中的嗜酸性粒细胞（EOS）水平，调整细胞因子辅助性T 细胞1 型细胞因子/辅助性T 细胞2 型细胞因子（Th1/Th2）平衡，起到抗炎和抗过敏作用。褚襄萍[12]通过实验证明，地龙酸性部位为平喘活性部位，共鉴定出该酸性部位含有的12 种脂肪酸；并且发现，酸性部位中去除脂肪酸类中低极性成分后，剩余的高极性成分降低哮喘小鼠BALF中EOS细胞数量的作用减弱，说明地龙脂肪酸对哮喘过程中炎症细胞水平有潜在的负调节作用。

目前文献报道中认为，次黄嘌呤可能是地龙平喘的重要活性成分之一。刘君怡[24]用含5%～20%甲醇的乙酸乙酯提取地龙平喘活性部位并进行了分离，得到了主要成分为核苷类（包括次黄嘌呤）的流分，并证明该流分可能通过抑制白三烯B4（LTB4）水平、促进Th1 细胞分泌γ-干扰素（IFN-γ）和Th2 细胞凋亡，改善平滑肌收缩并调节患者机体的免疫平衡，进而发挥平喘作用。本研究中次黄嘌呤的作用靶点包括乙酰胆碱酯酶（ACHE）和腺苷受体（ADORA）家族。

本研究中氨基酸的平均度值水平较低，但地龙中氨基酸的含量较高，对地龙的平喘作用可能有较大的贡献。KEGG 分析结果显示，地龙平喘作用可能与色氨酸代谢通路有关，脂肪酸、次黄嘌呤、含氮化合物等多种小分子参与了该通路的调节。色氨酸代谢产物有助于特异性免疫治疗减轻气道炎症作用，其机制与调控Th17 及调节性T 细胞（Treg）分化有关[25]。褚襄萍[12]从地龙平喘活性部位中分离出了主要成分为氨基酸的高极性部位，实验证明，该部位降低哮喘模型小鼠BALF上清液中免疫球蛋白E（IgE）、白细胞介素-4（IL-4）、IL-5、IL-13 水平的作用和总活性部位相比差异无统计学意义，故推断氨基酸可能是地龙发挥平喘作用的物质基础。此外，地龙中的一些含氮类化合物如4-（辛烷氧基）苯胺、二氢辣椒素和花生四烯酰胺等在本研究中具有较高的度值，可能与地龙其他成分共同发挥平喘作用。

哮喘是由多种细胞和细胞因子参与的气道炎症及气道高反应性（AHR）疾病，气道炎症是哮喘AHR 的基础，无论过敏性还是非过敏性哮喘气道炎症都以EOS 浸润和激活为最终共同途径[26]。花生四烯酸（AA）的生化代谢过程与炎症反应密切相关，其代谢产物白三烯（LT）和前列腺素（PG）是一类活性较强的炎症介质，可诱导免疫系统产生连锁反应，造成支气管痉挛，增加血管通透性，引起气道的水肿[27]。GO 生物过程分析结果显示，地龙活性化合物可通过花生四烯酸-5-脂加氧酶（ALOX5）、PTGS1、PTGS2 等靶点调节AA 代谢过程，推测该过程的调节是地龙提取物抑制哮喘模型动物BALF中EOS水平的主要途径之一。KEGG分析结果表明，地龙中的化合物可调节免疫细胞FcεRI 受体信号通路，该通路与对NF-κB 信号通路的激活密切相关[28]，广地龙可通过抑制NF-κB活化产生抗炎活性[11]。

胆碱能神经通过释放乙酰胆碱作用于气道内各效应细胞上的M1 和M3 型胆碱能受体而产生兴奋作用，从而导致气道平滑肌收缩[29]。KEGG 分析结果显示，地龙的平喘作用可能与胆碱能神经突触（cholinergic synapse）信号通路有关，涉及靶点为乙酰胆碱酯酶（ACHE）和毒蕈碱型乙酰胆碱受体（CHRM）家族。本研究通过设计离体气管诱导收缩模型实验，验证了地龙提取物对于胆碱能受体兴奋引起的气管平滑肌收缩的舒张作用。离体气管法是一种常用的筛选平喘药的实验方法，具有快速、方便、经济的特点，并可直接观察到药物对气管平滑肌的收缩和舒张作用[30]。毛果芸香碱是一种胆碱能受体激动剂，通过作用于气管平滑肌上分布的M 型胆碱受体导致气管平滑肌收缩。实验结果显示，不同质量浓度的地龙提取物能不同程度地抑制胆碱能神经兴奋引起的气管平滑肌收缩，该研究结果表明，地龙的平喘作用可能与胆碱能受体信号通路有关。

综上所述，本研究基于网络药理学方法初步研究了地龙平喘的活性成分、靶点和信号通路，发现地龙与平喘作用相关的活性化合物56 个、作用靶点67个、相关通路15条，讨论了脂肪酸、核苷酸、氨基酸和含氮分子等其他化合物调节AA 代谢过程、FcεRI 信号通路、胆碱能神经突触信号通路、色氨酸代谢通路与发挥平喘作用的关系，验证了地龙提取物对胆碱能受体兴奋造成的离体气管平滑肌收缩的舒张作用，说明地龙发挥平喘作用具有多成分、多靶点、多途径作用的特点。本研究从网络药理学角度阐释了地龙的活性成分、靶点及相关信号通路和生物过程，为地龙平喘作用的药效基础研究提供了参考。