甘草黄酮亚组分及甘草黄酮C对TNF-α致肠上皮屏障损伤的保护作用研究△

张娟，孙宇，徐晓琴，卿德刚

新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002

结肠是人体肠道的一部分，维持着消化系统的平衡。结肠上皮屏障功能障碍会引起消化不良、便秘、排便混乱等一系列症状[1]，因此，缓解结肠屏障功能损伤有利于消化道疾病的治疗。研究证明，黄酮类成分可以通过抑制炎症或者直接调节屏障功能，发挥改善肠道屏障功能的作用[2-4]。流行病学研究也表明，摄入黄酮类成分可以预防肠道炎症，从而降低炎症性肠病、结肠癌、2 型糖尿病、非酒精性肝炎等多种疾病的风险[3,5]。甘草黄酮临床上用于治疗胃及十二指肠球部溃疡，同时对炎症性肠病和结肠癌也有预防作用[6-8]，但是，现有研究并未完全阐明甘草黄酮中的活性成分，临床用药中无法实现对其质量的有效控制。本实验制备大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6 炎症模型，从甘草黄酮中筛选出抗炎活性亚组分，进一步考察活性亚组分及其主要成分对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的人结肠癌上皮细胞Caco-2 肠上皮屏障损伤模型的细胞因子分泌和屏障功能改变的影响，探讨两者对肠道屏障的保护作用和可能通路，为后续深入研究提供参考。

1 材料

1.1 细胞

IEC-6细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库；Caco-2 细胞来源于中国科学院上海细胞资源中心。

1.2 试药

甘草黄酮购自新农甘草产业有限责任公司（批号：2015H001，纯度＞45%）；胎牛血清（FBS，ExcellBio公司）；DMEM培养基、青霉素-链霉素双抗（PS，10 000 U）和胰蛋白酶（0.25%Trypsin-EDTA）均购自Gibco 公司；重组人胰岛素（Solarbio 公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）粉剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）；CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；Transwell小室（Corning公司）；白细胞介素-6（IL-6）、IL-8酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）；TNF-α（PeproTech 公司）；闭合小环蛋白-1（ZO-1）、咬合蛋白（Occludin）、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）、肌动蛋白（β-actin）抗体（Abcam 公司）；二甲基亚砜（DMSO）和柳氮磺胺吡啶（SASP）均购自Sigma 公司；异硫氰酸荧光素-右旋糖酐-40（FD-40）和甘草黄酮C（licoflavone C，LicoC）均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.3 仪器

SmartCellHF-90 型二氧化碳培养箱、HF1200LC型生物安全柜（上海力康仪器有限公司）；DK-80型台式低速离心机（上海飞鸽仪器有限公司）；EclipseTS100-F 型荧光倒置显微镜（日本Nikon 公司）；xMark 型酶标仪、Mini-PROTEAN Tetra system型转膜仪（美国Bio-Rad公司）；FLUO star OPTIMA型荧光酶标仪（德国BMG 公司）；Millicell-ERS 型电阻测定仪（美国Millipore 公司）；DYCZ-24DN 型电泳仪（北京六一仪器厂）。

2 方法

2.1 甘草黄酮亚组分制备

取甘草黄酮140 g以水混悬，乙酸乙酯等体积萃取3 次，挥干溶剂得到浸膏112 g。浸膏以硅胶柱色谱进一步分离，石油醚-丙酮梯度洗脱（100∶0、100∶5、10∶1、9∶1、8∶1、6∶1、4∶1）制备亚组分，最终收集了74 个亚组分，以薄层色谱法检识，选择组成有差异且相对单一的20 个亚组分（GCH1～GCH20）继续后续实验，见图1、表1。

表1 甘草黄酮亚组分信息

图1 甘草黄酮亚组分制备流程

2.2 细胞培养与单层细胞模型制备

IEC-6 细胞以培养基（DMEM+10%FBS+1%PS+100 μg·mL-1insulin），37 ℃，5%CO2培养。待融合率达90%时，胰酶消化，制备成5×104个/mL 的单细胞悬液。Caco-2 细胞以培养基（DMEM+10% FBS+1% PS），37 ℃，5%CO2培养。待融合率达80%时，胰酶消化。取指数期Caco-2细胞以5×104个/mL 接种于Transwell小室常规培养，2 d 更换1 次培养基，以电阻仪测定单层细胞跨上皮电阻（TEER）监测单层细胞形成情况，待TEER 稳定后，体外肠上皮单层细胞模型制备成功。

2.3 甘草黄酮亚组分对IEC-6细胞存活率的影响

取IEC-6单细胞悬液接种至96孔板（100 μL/孔），37 ℃、5% CO2培养24 h 至细胞贴壁。分设空白组、对照组、甘草黄酮各亚组分组（100 μL，20µg·mL-1溶液），根据分组以各亚组分干预，培养48 h后，弃培养基，每孔加入10%CCK-8 溶液100 μL，继续孵育1 h，酶标仪检测450 nm 处吸光度（A），根据公式（1）计算细胞存活率。

2.4 甘草黄酮亚组分对TNF-α 诱导的IEC-6 细胞IL-6 分泌的影响

IEC-6 细胞参照2.3 项下方法接种。设对照组、TNF-α模型组（100 ng·mL-1）、阳性对照组（SASP，2 mmol·L-1）和甘草黄酮各亚组分组（20 μg·mL-1），根据分组加入阳性药和亚组分提前干预2 h，之后加入TNF-α培养48 h，收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书方法检测各组IL-6水平。

2.5 GCH15化学成分分析

采用高效液相色谱分析筛选获得的抗炎活性组分GCH15的化学成分并测定其含量[9-10]。

2.6 GCH15 和LicoC 对TNF-α 诱导的Caco-2 细胞IL-6和IL-8分泌的影响

取Caco-2单细胞悬液接种至96孔板（100 μL/孔），37 ℃、5% CO2培养24 h 至细胞贴壁。分设对照组、TNF-α模型组（100 ng·mL-1）、阳性药对照组（SASP，2 mmol·L-1）组、GCH15低、中、高剂量（GCH15-L、GCH15-M、GCH15-H，5、10、20 µg·mL-1）组和LicoC低、中、高剂量（LicoC-L、LicoC-M、LicoC-H，5、10、20 μmol·mL-1）组。根据分组加入阳性药和亚组分提前干预2 h，之后加入TNF-α培养48 h，收集细胞上清液，按照ELISA 试剂盒说明书方法检测各组IL-6和IL-8水平。

2.7 GCH15 和LicoC 对TNF-α 诱导的Caco-2 单层细胞通透性的影响

参照2.2 项下方法，将Caco-2 细胞接种于Transwell小室，待TEER值稳定后，按2.6项下方法分组处理细胞。37 ℃培养48 h，分别检测处理前后TEER值。在Transwell小室顶端腔内加入HBSS溶液100 µL（含FD-40 1 mg·mL-1），37 ℃培养2 h，收集腔内溶液，荧光酶标仪测定荧光强度（激发波长480 nm，发射波长530 nm），实验组与对照组的FD-40 荧光值之比计为FD-40相对通过水平。

2.8 GCH15 和LicoC 对TNF-α 诱导的Caco-2 细胞Occludin、ZO-1及MLCK蛋白表达的影响

设对照组、TNF-α模型组（100 ng·mL-1）、GCH15 组（20 μg·mL-1提前干预2 h）和LicoC 组（20 μmol·mL-1提前干预2 h），培养48 h，提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，将蛋白转印至PVDF 膜，3% 脱脂奶粉封闭1 h，加入ZO-1、Occludin、MLCK 和β-actin 一抗，4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜，再加入二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜，ECL显影，考察目标蛋白的相对表达量。

2.9 统计分析

3 结果

3.1 甘草黄酮亚组分对IEC-6细胞存活率的影响

甘草黄酮有一定毒性，因此，基于预试验筛选结果，比较了20 个亚组分在质量浓度为20µg·mL-1时对正常IEC-6 细胞存活的影响。结果表明，除了GCH1、GCH5、GCH9、GCH13、GCH15 和GCH16，多数亚组分在该质量浓度下都会抑制IEC-6 细胞存活，见图2。

图2 甘草黄酮各亚组分对细胞存活率的影响（,n=3）

3.2 甘草黄酮亚组分对TNF-α 诱导的IEC-6 细胞IL-6 分泌的影响

结果表明，以TNF-α刺激IEC-6 细胞，能够明显促进细胞分泌IL-6（P＜0.05）。结果显示，各亚组分在质量浓度为20 µg·mL-1时均可抑制IL-6 分泌，并以GCH2、GCH4、GCH8、GCH15和GCH19的抑制效果最为显著（P＜0.05），见图3。综合各亚组分对正常IEC-6 细胞存活率的影响结果，选择GCH15进一步研究。

图3 甘草黄酮各亚组分对TNF-α诱导的IEC-6细胞IL-6分泌的影响（,n=3）

3.3 GCH15化学成分分析

为了明确GCH15中的活性成分，采用HPLC分析GCH15，并通过对照品比对，确认LicoC是GCH15的主要成分之一，质量分数为21.3%，见图4。

图4 GCH15和LicoC的HPLC图及LicoC结构式

3.4 GCH15 和LicoC 对TNF-α 诱导的Caco-2 细胞IL-6和IL-8分泌的影响

ELISA 结果显示，以TNF-α刺激Caco-2 细胞，能够明显诱导炎性细胞因子IL-6 和IL-8 的分泌（P＜0.01）。以GCH15 5、10、20 μg·mL-1和LicoC 5、10、20 μmol·mL-1提前干预则能显著降低Caco-2 细胞中IL-6 和IL-8 水平，并呈一定的剂量相关性，说明LicoC是GCH15中的抗炎活性成分，见图5。

图5 GCH15和LicoC对TNF-α诱导的Caco-2细胞炎性因子分泌的影响（,n=3）

3.5 GCH15 和LicoC 对TNF-α 诱导的Caco-2 单层细胞通透性的影响

与对照组比较，TNF-α刺激Caco-2 单层细胞可引起TEER值降低（P＜0.01）和FD-40相对通过水平升高（P＜0.01），表明单层细胞通透性增加，屏障功能紊乱。与模型组比较，以GCH15 5、10、20 μg·mL-1和LicoC 5、10、20 μmol·mL-1提前干预能提高TEER值，降低FD-40相对通过水平，并呈一定的剂量相关性，说明两者有利于保护肠道屏障完整性，对TNF-α诱导的屏障功能损伤具有保护作用，见图6～7。

图6 GCH15和LicoC对TNF-α诱导的Caco-2单层细胞TEER的影响（,n=3）

图7 GCH15和LicoC对TNF-α诱导的Caco-2细胞FD-40通过水平的影响（,n=3）

3.6 GCH15和LicoC对ZO-1和Occludin表达的影响

TEER值下降和FD-40相对通过水平升高，提示紧密连接结构受到破坏，故以免疫印迹法（Western blot）检 测GCH15 和LicoC 对ZO-1 和Occludin 表 达的影响。结果表明，TNF-α的刺激可使Caco-2 细胞ZO-1 和Occludin 蛋白表达水平降低（P＜0.01）。以GCH15 20 μg·mL-1和LicoC 20 μmol·mL-1提前干预则能逆转TNF-α引起的ZO-1 和Occludin 蛋白表达水平降低（P＜0.05，P＜0.01），说明两者可以通过保护紧密连接结构维持肠道屏障功能，见图8。

图8 GCH15和LicoC对TNF-α诱导的Caco-2细胞ZO-1和Occludin蛋白表达的影响（,n=3）

3.7 GCH15和LicoC对MLCK表达的影响

TNF-α刺激Caco-2 单层细胞，可以明显促进MLCK 蛋白表达（P＜0.01）。以GCH15 20 μg·mL-1和LicoC 20 μmol·mL-1提前干预，则能逆转TNF-α引起的MLCK 蛋白表达上调（P＜0.01），说明两者可能通过调节MLCK，防止肠道屏障紧密连接功能紊乱，见图9。

图9 GCH15和LicoC对TNF-α诱导的Caco-2细胞MLCK蛋白表达的影响（,n=3）

4 结论

肠上皮细胞和封闭细胞旁间隙的连接复合体是肠道屏障的结构基础，其中紧密连接对调节细胞旁转运和维持屏障完整性至关重要[11]。紧密连接由50多个前蛋白组成，包括ZO-1、ZO-2 和ZO-3 等细胞质外周膜蛋白，以及Occludins 和Claudins 等跨膜蛋白[12]。ZO-1 在紧密连接功能中起着直接和间接的中心作用，不仅能够连接跨膜蛋白（Occludins 和Claudins）和其他紧密连接蛋白、肌动蛋白骨架，而且可以调节细胞旁通道[13]。炎性刺激和其他内源性细胞因子通过减少紧密连接蛋白的定位与表达直接影响肠上皮屏障，肠上皮屏障通透性增加又会促使内毒素和促炎因子更易移位于组织内部，导致慢性炎症持续存在。因此，维持细胞间结构完整、改善肠上皮屏障功能，有助于改善消化道疾病引起的炎症反应。

TNF-α是引起肠道屏障损伤的重要启动因子，不仅可以通过MLCK 通路重塑细胞骨架，引起紧密连接前的肌动球蛋白环收缩和紧张性增加，促使ZO-1 和Occludin 等紧密连接蛋白和周围细胞骨架蛋白重新分布、紧密连接结构移位、细胞旁通路开放、肠道通透性增加，而且还会诱导IL-6 和IL-8 等细胞因子分泌，推动炎症级联反应，进一步加剧紧密连接结构的损伤[14-16]。本实验首先利用TNF-α诱导的IEC-6炎症细胞模型，从甘草黄酮中筛选出抗炎活性亚组分GCH15，并通过HPLC 对照品指认法确认其主要成分是LicoC。进而，以TNF-α诱导的Caco-2肠道屏障损伤细胞模型，考察GCH15 和LicoC 对炎症反应的抑制作用和对屏障功能的保护作用。结果显示，以TNF-α刺激可以促进Caco-2 细胞分泌IL-6和IL-8，降低单层细胞TEER值，提高FD-40相对通过水平，GCH15 和LicoC 则能明显逆转TNF-α引起的炎症反应及细胞屏障功能紊乱，两者均以剂量依赖的方式抑制IL-6 和IL-8 分泌，增加单层细胞TEER 值，降低细胞间通透性，即能够通过抗炎和维持屏障完整性发挥对肠道屏障功能的保护作用。TNF-α可以促进Caco-2 细胞MLCK 表达，而MLCK过表达可以诱导肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化，从而调节肌动蛋白收缩、细胞骨架重塑[17]，引起ZO-1和Occludin 等紧密连接蛋白表达与分布的变化，弱化紧密连接屏障功能，升高屏障通透性[18]。有研究证实，以MLCK 抑制剂抑制MLCK 信号通路的激活，可以改善结肠炎小鼠的肠黏膜屏障功能[19]。因此，进一步以Western blot检测了GCH15 和LicoC 对紧密连接蛋白和MLCK表达的影响。结果，以TNF-α刺激Caco-2 细胞，ZO-1 和Occludin 表达明显下降，MLCK 表达明显升高，提示MLCK 通过调节紧密连接蛋白参与了屏障功能的改变，以高剂量的GCH15和LicoC 提前干预Caco-2 细胞，则可以逆转TNF-α诱导的ZO-1 和Occludin 表达下降、MLCK 表达升高，说明两者可能是通过MLCK 调节紧密连接，从而维持肠道屏障完整性的。

甘草黄酮虽已应用于临床，但是受研究深度的限制，其中的活性成分并未被完全阐明，目前仅以总黄酮含量作为质量控制指标。本实验通过体外实验筛选出甘草黄酮中的活性成分LicoC，进行单体层次上的活性评价，为阐明甘草黄酮活性成分、有效控制产品质量提供了基础数据，并且，一定程度上拓展了对甘草保护胃肠道的认识。但是，本实验只是体外考察，后续还需要进行体内验证，并应深入、细化筛选，以明确甘草黄酮中的活性物质组，为阐释甘草黄酮组效关系提供更充分的依据。