自然杀伤细胞活性及其受体和配体的调节在复发性流产中的作用研究进展

孙梦晨，张 宁，苗秀明

(1.山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学，山东 济南 250355；3.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指当孕龄妇女与同一性伴侣连续发生2次或2次以上的自然流产[1]。研究表明，自然杀伤(natural killer，NK)细胞活性失衡是RSA发生的关键因素之一[2]。NK细胞分泌的相关细胞因子、趋化因子以及NK细胞受体、配体数量或功能的改变均会影响NK细胞的活性，即NK细胞活性的平衡可以细化为受体、配体以及相关免疫细胞及趋化因子等分子的平衡。本文将围绕NK细胞活性及其受体、配体等分子的调节在RSA中的作用研究进展进行综述，从分子免疫学角度研究NK细胞活性调节的机制及其在RSA发生发展中的作用。

1 NK细胞的活性与正常妊娠

子宫蜕膜NK细胞(decidual NK cells,dNKs)是NK细胞中一类与正常妊娠关系密切的细胞。妊娠期间dNKs在促进螺旋动脉重塑、调节母胎免疫耐受方面发挥重要作用，是母胎界面的主要免疫细胞，能够通过分泌血管内皮因子、白细胞介素(interleukin,IL)等活性因子促进滋养细胞侵袭蜕膜组织以及螺旋动脉的重塑，进而利于子宫胎盘血液循环的建立，为妊娠的正常进行、胎盘发育能力的调节提供保障[3]。此外，正常妊娠属于同种半异体移植，需要免疫系统与胚胎互不排斥，NK细胞可以通过调节杀伤免疫球蛋白受体(kill immunoglobulin receptors，KIR)、C型凝集素样受体(C-type lectin receptor，CLR)以及人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)等配体，传递激活或抑制信号来调节NK细胞的活性，进而在母胎界面发挥同种免疫调节作用，减弱对胎儿的排斥作用，增强免疫耐受。

2 NK细胞受体与NK细胞活性

NK细胞受体根据结构的不同分为KIR、免疫球蛋白样转录物(immunoglobulin like transcripts，ILT)、CLR及天然细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptors，NCR)4类。其中，ILT的2个亚型ILT2和ILT4与NK细胞活性密切相关；CLR因其具有一个或多个C型凝集素样结构域而命名，主要包括CD94/自然杀伤细胞家族2(natural killer group 2，NKG2)以及CD69和CD161等。KIR、ILT和CLR家族按功能可分为抑制性受体和活化性受体2类。

2.1 KIRKIR具有高度多态性，按单倍体分类，分为A、B型2型，A型主要包含编码抑制基因(2DL1、2DL2、2DL3、2DL5A、2DL5B 3DL1、3DL2和3DL3)和唯一一个激活基因2DS4，而B型单倍体主要以激活基因(2DL4、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、2DS5和3DS1)为主。研究报道，RSA患者B型单倍体KIR明显增多，抑制性KIR基因相对减少，从而导致机体免疫失衡[4]，因此推测KIR激活基因过多导致了子宫微环境的改变，从而过度激活了NK细胞的活性，最终引发RSA。然而，MANSOUR等[5]研究发现，主要起激活作用的B型单倍体占主导是保证正常妊娠的重要前提。另外，有研究表明，KIR的B型单倍体基因2DS1的激活促进了NK细胞的激活作用，而NK细胞在一定范围内的活性有利于胚胎滋养层细胞侵袭蜕膜组织，对于胚胎正常着床、发育具有积极作用[5]。综上，KIR基因多态性影响了NK细胞的功能，其抑制性受体与激活性受体共同作用使机体免疫系统处于一个相对平衡的状态，这是保证成功妊娠的前提之一。

2.2 ILTILT属于免疫球蛋白超家族，ILT2表达于NK细胞表面，ILT4表达于巨噬细胞、单核细胞等免疫细胞表面，ILT2与ILT4均能够直接或间接影响NK细胞功能。陈静等[6]研究发现，RSA女性的蜕膜组织中ILT4和ILT2 mRNA表达水平显著低于健康女性。ILT2、ILT4均属于抑制性受体，其表达下降时，对抑制性信号的传递以及对NK细胞活性的抑制也相应减弱，导致NK细胞的活性增强，杀伤正常细胞，使机体对胚胎产生排斥作用。由于研究样本量的限制以及对ILT与RSA之间的研究尚较少，上述结论和相关机制还需进一步研究。

2.3 CD94/NKG2CD94/NKG2是NK细胞受体家族成员之一，NKG2家族包括抑制性受体NKG2A以及激活性受体NKG2C、NKG2D等。NKG2A作为唯一的抑制性受体，在维持妊娠妇女母胎界面免疫平衡方面有着重要意义。刘子平等[7]研究发现，RSA女性蜕膜组织中NK细胞的NKG2A的表达水平明显下降，NKG2D的表达水平明显升高，推测可能是RSA患者的NK细胞结合了大部分CD94/NKG2中的激活性受体，导致激活性信号过度传导，使NK细胞活性显著增加，而活性显著增加的NK细胞可杀伤自身其他细胞甚至胚胎，导致流产反复发生。

2.4 CD69和CD161CD69和CD161的异常表达能够诱导细胞因子分泌并引发NK细胞的杀伤活性。研究报道，子宫NK细胞(uterine natural killer cells，uNKs)中的CD161在RSA患者中表达水平较正常育龄女性明显降低[8]，推测CD161的低表达使其与他因子的结合降低，从而降低了NK细胞原有的活性水平。与CD161比较，CD69目前在RSA领域乃至其他学科中的研究较少。CD69是一类能够激活NK细胞的特异性标志物之一，CD69水平的升高可调动机体内同种免疫调控机制，使NK细胞杀伤活性增加，最终导致了机体免疫紊乱的发生[9]。研究发现，CD69表达水平在多次发生自然流产女性外周血中明显升高，提示外周血中CD69的高表达可能是女性易患RSA的预测指标之一[9]。

2.5 NCRNCR包括NKp46、NKp44和NKp30。其中NKp46能够产生干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等细胞因子，主要表达于CD56bright与部分CD56dim细胞表面。NKp46与NK细胞的活性密切相关，dNKs中的NKp46可以介导细胞毒性作用。研究显示，RSA患者外周血单核细胞与胎盘中NKp46的表达水平较健康女性升高[10]。正常妊娠中NKp46未表现出毒性作用，其机制可能涉及2个原因，即缺失配体或其毒性活性被抑制性受体NKG2A所抑制。NKp30是另一激活性受体,有报道认为，NKp30-a、NKp30-b亚型在RSA患者胎盘中检测出的频率较健康女性高，而在外周血单核细胞中与对照组无显著差异[10]。在免疫紊乱的RSA女性中，NKp30-a和NKp30-b这2种亚型表达的变化可导致IFN-γ、TNF-α等促炎因子的异常表达，使dNKs过度激活而引发流产。

3 NK细胞配体与NK细胞活性

NK细胞的主要配体之一人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-Ⅰ类基因与NK细胞的关系密切。HLA-Ⅰ类基因分为经典与非经典2大类，前者包括HLA-A、HLA-B、HLA-C 3种分型，与抗原提呈和免疫调控有关；后者包括HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H，参与滋养细胞侵袭过程。HLA-C基因是KIR的配体，在RSA患者可同时表达HLA-C型基因与KIR的特定基因，说明在HLA和KIR共表达的情况下易导致NK细胞功能异常。HLA-G多与NK细胞的抑制性受体如ILT2和KIR2DL4相结合，在增强妊娠期间的免疫耐受方面具有重要作用[11]。推测其作用机制为HLA-G 与ILT2以及KIR2DL4的结合阻断了NK细胞活化通路，进而阻碍了突触活化性信号的传输，NK细胞发挥杀伤活性作用的路径被切断，并且KIR2DL4与HLA-G结合后可通过分泌细胞活性因子等物质来刺激衰老的NK细胞生成新的胎盘血管，为胚胎提供充足的血供、营养[12]。HLA-G通过形成先导序列多肽的方式诱导胎盘组织中 HLA-E的表达，HLA-E自身或结合其他HLA-Ⅰ类基因形成HLA先导肽/HLA-E复合体后，与受体NKG-2A/CD94结合而保证NK细胞的活性，对维持胚胎的血供、营养起到良性作用[13]。

4 其他相关免疫细胞及趋化因子对NK细胞活性的调节

4.1 辅助性T细胞(helper T cell,Th)1/Th2RSA患者大多数情况下同时存在NK细胞活性不足以及Th1/Th2细胞平衡偏倚的情况。研究发现，dNKs作用于蜕膜树突细胞后，其表面活性物质的表达受到抑制，且dNKs促进了Th2型细胞的增殖[14]。Th2型细胞分泌以IL-4、IL-5和IL-10等细胞因子为主，介导体液免疫的发生；Th1型细胞调节机体细胞免疫，主要分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α等细胞因子，RSA患者Th1/Th2的平衡向Th1型细胞偏倚，使IFN-γ分泌增多，而高水平IFN-γ可导致NK细胞的增殖，导致其活性异常增加而引发流产[15]。

4.2 调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)/Th17Treg和Th17细胞属于CD4+T淋巴细胞亚群，Treg可通过分泌IL-10等细胞因子、抑制T细胞的分化增殖以及诱导靶细胞凋亡等途径调控机体的免疫耐受。Th17细胞主要分泌IL-17以促进炎症反应的发生。dNKs能够促进Treg的增殖与分泌、抑制Th17细胞的增殖并促进Th17细胞的消耗，这些功能维持了Treg/Th17的平衡，提高了妊娠期间胚胎的免疫耐受，减少了因免疫紊乱而导致的机体对胚胎的不良作用[16]。研究显示，NK细胞表达水平与Th17细胞呈负相关，而IFN-γ由NK细胞分泌，因此，NK细胞功能的改变、比例的增加可诱导IFN-γ对Th17细胞的杀伤作用[14]。综上，Treg/Th17可调节NK细胞的活性，Treg/Th17失衡可引发胚胎停育。

4.2.1 Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)及其配体在机体需要免疫防御时，TLR4受到刺激后激活TLR4-核因子-κB信号传导通路，促进IL-6、TNF-α等细胞因子发挥作用，恢复免疫稳态。研究显示，RSA患者体内TLR4基因表达水平降低，且与Treg表达水平呈正相关，与Th17细胞表达呈负相关[17]，说明TLR4可引起Treg/Th17免疫失衡。脂多糖作为TLR4的配体可激活Treg的增殖使Treg与Th17的比例保持平衡[18]。有研究报道，TLR4在体内的过度表达可引发NK细胞对胚胎的免疫排斥[19]。另外，有研究报道，RSA患者蜕膜组织Treg中TLR9表达水平显著降低，与配体的结合减少，最终影响Treg功能[17]。TLR9配体CpG寡核苷酸可促进Treg的增殖、分化且同时可协调其免疫功能，从而有利于维持Treg/Th17平衡[20]。

4.2.2 B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1(B lymphocyte-induced maturation protein-1,Blimp-1)Blimp-1是一种抑制性转录因子，可作用于多种固有免疫细胞。有研究报道，Blimp-1在RSA患者中呈高度表达[21]，推测其原因是Blimp-1促进了Treg增殖，抑制了Th17细胞功能，减少了Th17细胞数量，使Treg/Th17比例失衡，引发机体免疫紊乱，从而导致RSA的发生。

4.3 趋化因子及其受体CXC趋化因子配体16(CXC chemokine ligand 16,CXCL16)属于趋化因子家族成员，在正常早孕期女性的滋养细胞中呈高表达，其唯一受体为蜕膜免疫细胞CXCR16，二者相互作用为胚胎的发育提供保障。近期有研究表明，CXCL16通过对巨噬细胞的诱导，使巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞，M2型巨噬细胞可调整Th1型细胞中IL-15的数量而发挥对NK细胞活性的调节，使NK细胞活性达到最适宜妊娠的程度[22-23]。CXCL12及CXCR4也是影响NK细胞活性的一组趋化因子及其受体。有研究报道，RSA女性滋养细胞CXCL12和CXCR4表达水平降低，使滋养细胞的增殖分化严重受阻，dNKs中维持正常妊娠的CD56brightCD16-分型募集失败，发挥细胞毒性的CD56dimCD16+分型占绝大多数[21]，胎盘发育与动脉血管的重塑过程受阻，因而无法维持正常妊娠。除上述2类趋化因子，CC亚组CCL2水平也可预测RSA的发生[24]，其机制可能与CCL2上调一种细胞因子信号抑制因子而抑制NK细胞杀伤活性有关[25]。

4.4 巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)MIF由巨噬细胞分泌，能够抑制巨噬细胞的移动，参与机体免疫反应。妊娠需要各种免疫因子的调节，MIF在促进胎盘血管发育、维持母胎界面的正常免疫耐受方面发挥重要作用。李岐佩等[26]研究发现，有2次及2次以上自然流产史的女性患者MIF水平显著低于正常育龄期女性。基于MIF功能，推测因MIF在RSA女性体内的减少导致其抑制巨噬细胞的作用减弱，使巨噬细胞分泌各种抑制性细胞因子减少，进而使妊娠期包括NK细胞在内的主要免疫细胞活性过强，妊娠过程受到免疫排斥，导致胚胎死亡。

5 NK细胞活性与RSA

目前已有充足证据表明，NK细胞活性异常与不良妊娠结局的发生密切相关[27-28]，其机制包括2个方面：一方面是NK细胞功能亢进，杀伤活性增强，导致NK细胞过多分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子，引起机体免疫功能紊乱，超出免疫耐受范围，使NK细胞攻击自身细胞甚至胚胎而导致RSA。目前，有利于妊娠的NK细胞的活性范围尚无统一标准，临床中应结合病史、辅助检查等对免疫性RSA进行综合诊断。另一方面是NK细胞活性不足可导致螺旋动脉重塑紊乱以及滋养细胞侵袭不足，胎盘无法供应足够的血流及营养，造成胚胎停育。pNKs可产生趋化因子与分泌因子，促进妊娠滋养细胞的侵袭，有利于将更多的氧气与营养运输到胎盘[3]。此外，妊娠女性子宫内保持适当数量的NK细胞可减少微生物感染[29]。综上，只有NK细胞活性在妊娠时期母胎界面处于一种免疫平衡状态，发挥适当的免疫活性，才能保护胚胎，防止流产的发生。

6 总结与展望

人体的免疫系统庞大而复杂，任何一类分子的变化可直接或间接影响另一类分子的功能。NK细胞的受体、配体以及相关免疫细胞和趋化因子应在体内保持动态平衡，既不能过度抑制，亦要合理控制活性程度，否则将会导致机体的免疫失衡。在妊娠期这种免疫失衡可导致流产的发生。NK细胞的受体、配体以及相关免疫细胞和趋化因子等分子可为RSA预后的判断以及免疫治疗疗效的评判标准的制定提供参考价值。然而，仅有少数较成熟的研究成果，多数研究结论还有待今后进一步的验证。