核仁小RNA：肿瘤及其他多种疾病的新型分子标志物*

2021-12-01孙洁璇综述姜晓峰审校

国际检验医学杂志 2021年12期

孙洁璇，高卓综述，姜晓峰审校

哈尔滨医科大学附属第四医院检验科,黑龙江哈尔滨 150028

随着新一代测序技术和生物信息学技术的发展，人们对多种疾病致病及易感基因的了解越来越深入，而非编码RNA(ncRNA)家族无疑是近年来分子生物学领域研究的热点，其在多水平调控着疾病进程中关键基因的表达。ncRNA家族成员可分为两种主要类型：基础结构型和调控型。从表观遗传学的角度来看，调控型ncRNA更受关注。核仁小RNA(snoRNA)长度为60～300个核苷酸，在脊椎动物中大多数由内含子区编码产生，每个内含子编码产生的snoRNA不超过1个[1]，因此snoRNA是ncRNA家族中最具特征的一类。snoRNA的传统功能被认为是参与核糖体RNA(rRNA)转录过程中假尿苷化和2′-甲基化修饰。已有研究表明，在黑色素瘤、卵巢癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等恶性肿瘤及其他多种疾病中，snoRNA都存在异常表达，且发挥着重要的调控作用[2-6]。此外，snoRNA在血清标本中可以稳定存在且更易于检测[7]。因此，snoRNA有望作为肿瘤及其他多种疾病早期诊断、疗效检测、预后评估的潜在分子生物学标志物[7]，并可能为药物治疗提供新的靶点。

1 snoRNA基础结构及生物学功能

snoRNA主要定位于核仁或Cajal小体，根据保守序列的结构不同主要分为Box C/D和Box H/ACA两个家族[8]。Box C/D snoRNA存在两个短的保守序列，分别位于5′和3′末端附近的C盒(UGAUGA)和D盒(CUGA)，而Box H/ACA snoRNA则是共有的发夹-铰链-发夹-尾巴结构，该结构在铰链区(ANANNA，其中N是任意核苷酸)中包含1个保守序列H盒，并在其中包含1个ACA盒分别形成C型和发夹型结构。snoRNA必须与相应蛋白复合物结合形成核仁小核糖核蛋白复合体(snoRNP)以便于开启后期功能。Box C/D snoRNA与4个必需纤维蛋白(Nop1p、Nop56p、Nop58p和15.5-kDa/Snu13)结合形成snoRNP，指导其RNA靶标的2′-O-核糖甲基化。而Box H/ACA snoRNA则可与蛋白质Cbf5、Nop10、L7Ae和Gar1结合形成snoRNP，指导RNA靶标假尿苷化[9]。最近还发现了不以碱基配对的方式识别靶向序列的Box C/D snoRNA，称为孤儿snoRNA[10]。

除了基础的修饰外，snoRNA可能是细胞代谢、应激反应的关键介质。MICHEL等[11]发现,在棕榈酸酯诱导的氧化应激模型中，3种snoRNA(SNORD32A、SNORD33、SNORD35A)的缺失会使细胞免受脂肪毒性，而在经脂多糖处理的小鼠肝组织中，SNORD32A、SNORD33、SNORD35A的表达显著上调。此外，在缺氧条件下SNORD14A和SNORD83B的表达显著上调[12]。虽然snoRNA主要参与RNA转录过程的修饰，但是研究发现snoRNA可以像微小RNA(miRNA)一样发挥功能，是某些miRNA的前体。ENDER等[13]发现,snoRNA ACA45衍生出20～22个核苷酸的RNA能够抑制靶基因CDC2L6的表达，类似于miRNA。此外，YIN等[14]发现，在HeLa细胞和人类胚胎干细胞中存在长链非编码RNA(LncRNA)，LncRNA两个末端各包含1个snoRNA序列。还有研究发现，SNORD50A过表达或缺失都会影响信使RNA(mRNA)3′端的加工效率，说明snoRNA在mRNA 3′端加工中起到重要的调节作用[15]。

2 snoRNA与肿瘤

2.1snoRNA与肿瘤的早期诊断早期有效诊断可明显延长肿瘤患者的生存期，肿瘤发现的早晚决定了患者的治疗方式和预后。snoRNA与肿瘤的发生、发展密切相关，在血液标本中以高丰度稳定存在，拥有早期诊断类分子标志物的基本特质，具备作为大范围体检指标的潜力。MEI等[16]发现，SNORA42在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中高表达，并可以促进人类NSCLC细胞的增殖及小鼠体内NSCLC组织的生长，起到癌基因的作用。LIAO[7]等对NSCLC患者NSCLC组织与正常组织的研究发现，高表达于NSCLC组织的snoRNA(SNORD33、SNORD66和SNORD76)联合诊断NSCLC的灵敏度为83.8%，特异度为96.2%。SNORD76不仅在NSCLC中高表达，还在肝细胞癌中高表达。WU等[17]通过受试者工作特征曲线验证了SNORD76在肝细胞癌早期诊断中有较高的应用价值(曲线下面积为0.73)。有研究发现，在人类前列腺癌组织中高表达SNORA55，沉默该基因的表达可抑制前列腺癌细胞的增殖和转移[18]。ZHU等[19]研究发现，过表达SNORD89可导致卵巢癌细胞停滞在细胞周期的S期，使卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力增强。可见，snoRNA可以成为肿瘤诊断的一类新的分子标志物。

2.2snoRNA与肿瘤的预后 snoRNA不仅能够影响肿瘤的发生、发展，其对肿瘤的不良预后也有一定提示作用。SUN等[20]发现，SNORA7B在乳腺癌中起到致癌基因的作用，SNORA7B的表达与癌灶大小和淋巴结转移呈正相关，并且高表达SNORA7B的乳腺癌患者总体生存率明显降低。SNORA7B可以为乳腺癌患者提供准确的预后评估。HE等[21]研究发现，SNORD16在结肠癌组织中表达明显上调，高、低SNORD16表达组患者的5年生存率分别为56.0%和78.4%。与癌旁组织相比，肝细胞癌组织中SNORD78表达上调，并且SNORD78的高表达会导致患者总生存期及无复发生存期缩短[22]。SNORD78也与NSCLC的预后不良有关，SNORD78高表达患者的预后明显差于低表达患者[23]。此外，多种snoRNA联合检测对肿瘤预后不良有更高的预测价值，例如在胃癌中高表达的8种snoRNA(ACA47、E2、ACA10、SNORA58、HBII-316、U70、U8和U66)[24]，在头颈部鳞状细胞癌中高表达的5种snoRNA(SNORD114-17、SNORA36B、SNORD78、U3chr2及U3chr17)[25]，在肾透明细胞癌中高表达的6种snoRNA(SNORA2、SNORD12B、SNORA59B、SNORA70B、SNORD93和SNORD116-2)[26]，以及在NSCLC中高表达的6种snoRNA(SNORA47、SNORA68、SNORA78、SNORA21、SNORD28和SNORD66)[27]。

2.3snoRNA作为肿瘤的治疗靶点沉默snoRNA介导的转录途径是肿瘤的治疗靶点。XU等[28]发现，SNORD47在体内和体外都可以显著抑制神经胶质瘤细胞的生长和增殖。虽然替莫唑胺作为治疗胶质母细胞瘤的一线化疗药物，但其耐药性限制了治疗效果，而SNORD47在抑制体内肿瘤生长方面与替莫唑胺具有协同作用。此外，SNORD76在肝细胞癌中表达水平明显增高，其通过诱导G0/G1期细胞而发挥作用，为治疗肝细胞癌提供了潜在的靶点[17]。SNORA21在结直肠癌中过表达，其通过调控S期细胞促进肿瘤浸润，这可能成为结直肠癌的潜在治疗靶点[29]。CUI等[30]发现，SNORA23仅在胰腺导管腺癌组织中表达，在非胰腺导管腺癌组织中未检测到，并且在胰腺导管腺癌细胞中SNORA23的表达水平与侵袭能力呈正相关，与患者无病生存期呈负相关；在小鼠体内发现抑制SNORA23的表达可抑制肿瘤的形成，为胰腺导管腺癌提供了一个新的治疗靶点。

2.4snoRNA参与肿瘤的病理过程随着对snoRNA研究的不断深入，QIN等[31]发现，沉默SNORA74B可通过诱导PH域富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶(PHLPP)基因表达及抑制蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路来抑制胆囊癌细胞的增殖。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路异常激活是引起肺癌的机制之一[32]。TANG等[33]发现,抑制SNORA71A表达后，MAPK/ERK信号通路中的ERK1/2磷酸化水平也会被抑制。此外，胞内磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号通路的异常激活也是引起肿瘤的机制之一，在肝细胞癌中高表达的snoRNA ACA11和SNORD126都是通过激活PI3K/AKT信号通路来促进肝细胞癌增殖、迁移和侵袭[34-35]。WANG等[36]发现，敲除在肝细胞癌中高表达的SNOU2-19可以诱导细胞质内β-连环蛋白(β-catenin)易位，抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而影响癌细胞的增殖。上皮间质转化(EMT)是肿瘤细胞侵袭和转移的重要标志，也是浸润性癌的特征之一[37]，SNORD76通过诱导EMT促进肝细胞癌的侵袭[17]，SNORD47通过诱导EMT促进肝细胞癌的发生[38]。

3 snoRNA与其他疾病

3.1遗传性疾病普拉德-威利综合征(PWS)是一种父源染色体15q11.2-q13区域印记基因功能缺陷所导致的遗传性疾病，其临床表现主要为认知障碍、发育迟缓、睡眠异常和导致肥胖的暴饮、暴食。研究发现，在小鼠PWS模型中SNORD116的缺失更容易出现出生后体质量低、身材矮小、骨量减少、贪食和能量消耗改变[6]，而SNORD115则与各种心理和行为变化(如自闭症)有关[5]。

3.2自身免疫性疾病系统性红斑狼疮(SLE)是一种以细胞免疫和体液免疫功能障碍为特征，并介导组织器官损伤的自身免疫性疾病，其主要发病机制是T和B淋巴细胞的高度活化和功能异常。LAI等[4]发现，SLE患者T淋巴细胞中SNORA12的表达水平降低，并且其表达水平与SLE疾病活动度评分呈负相关。SNORA12表达水平的升高明显抑制了干扰素(IFN)-γ的分泌，而IFN-γ是一种关键的促炎细胞因子，其在SLE患者的血清中水平升高，提示SNORA12表达水平降低可能通过使SLE患者T淋巴细胞和IFN-γ分泌增加，促进SLE的发病。

3.3血液系统疾病在原发性急性髓细胞白血病(AML)中最常见的染色体易位是t(8;21)，而这种易位产生的融合基因AML1-ETO可发挥特异性癌基因的作用，增强造血干细胞的自我更新能力。ZHOU等[3]发现，AML1-ETO诱导自我更新的关键机制就是使rRNA 2′-O-甲基化的Box C/D snoRNP增加，而该途径也可能成为AML潜在的治疗靶点。

4 snoRNA检测方法

snoRNA具有作为肿瘤及其他多种疾病早期诊断、预后评估的生物标志物的潜力，如何准确检测snoRNA的表达水平也是当前研究的热点之一。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是目前应用最广泛也是最便捷的snoRNA检测方法之一，主要包括TaqMan探针法和荧光染料法。TaqMan探针法的优点在于减少工作量，但需要根据序列合成不同的探针，成本也相对较高。荧光染料法虽然成本较低，但可能会产生非特异性产物，出现假阳性信号，影响检测结果。数字PCR(dPCR)是一种不需要依赖标准曲线的核酸绝对定量技术。有研究发现，dPCR对抑制物(乙二胺四乙酸、肝素等)的耐受程度比RT-qPCR高，出现假阴性的概率相对较低、灵敏度较高[39]。高通量测序在snoRNA检测方面具有数据量大、拓展性强的优势，但同时也存在局限性。由于高度同源区域的存在会使高通量测序的覆盖范围不足而出现假阴性结果，也会产生交叉反应导致假阳性结果，而致病性突变基因的捕获效率也会受GC含量的影响，可能出现假阴性结果。此外，测序能力取决于同时包含过滤阴性基因和标注阳性基因的全面性数据库，而目前也亟需具有国际性标准的数据库[40]。

5 snoRNA相关数据库

为了更方便快捷地研究snoRNA，目前已建立了多个相关数据库。有主要针对snoRNA基本结构、序列的数据库，例如：snoRNA-LBME-db、sno/scaRNAbase数据库等；还有为了方便查询snoRNA基因座中核苷酸变异位点的数据库snoLOVD；还有更倾向于snoRNA在肿瘤方面相关研究的数据库SNORic，其可以查询snoRNA在肿瘤中的表达情况、生存曲线分析，以及基因的相关性分析等信息。而数据库snoDB则整合了上述几个数据库的基因相关信息和多种功能，可以查询到更全面的信息。