弗林蛋白酶裂解位点在微生物感染宿主中的作用

高明燕 姜 逸 程 旭 俞 燕 范建华 孟 闯

1.中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州 225125；2.江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏省高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009

弗林蛋白酶（Furin）裂解位点广泛存在于微生物前体蛋白中，如绿脓杆菌外毒素A、白喉毒素和炭疽毒素等细菌外毒素以及人免疫缺陷综合征病毒、埃博拉病毒、麻疹病毒、乙肝病毒、流感病毒等很多病毒的囊膜糖蛋白。这些病原前体蛋白需要宿主细胞中的Furin 裂解成成熟蛋白才能在感染宿主的进程中进一步发挥作用。微生物前体蛋白上Furin 裂解位点的作用关键而重要，故本文将从Furin裂解位点的特点、病毒囊膜蛋白Furin裂解位点与病原感染宿主过程中毒力、宿主和细胞嗜性的相关性及其对微生物传播效率和规模的影响等方面进行详细综述。

1 弗林蛋白酶及其裂解位点特点

Furin 是真核动物体内一种高度特异性的丝氨酸内切蛋白酶，属于前体蛋白转化酶家族，能识别切割前体蛋白进而激活其活性。其广泛存在于各种组织和细胞中，主要定位于细胞高尔基体反面膜囊上。它作用的底物不仅包括宿主肽类激素和神经肽、生长因子、血清蛋白、基质金属蛋白酶、受体等，还包括细菌外毒素和很多囊膜病毒的糖蛋白[1]。

Furin 能识别切割的最短序列特点是R-X-XR↓；其核心序列包括8 个氨基酸，顺序为P6-P5-P3-P4-P3-P2-P1↓P1’P2’。裂解位点P1 和P4 位必须为R(精氨酸，Arg)；X 为任意氨基酸；若P2位为碱性的K（赖氨酸，Lys）或R 时，其切割效率能提高10 倍左右；此外P4 位不是R 时，P1 位必须是R，P2和P6 位是碱性氨基酸才能保证切割效率[2-3]。P2’位常可找到脂肪族氨基酸V（缬氨酸，Val）和I（异亮氨酸，Ile）。研究发现Furin 底物中裂解位点类型统计百分比：R-X-R–R↓为41%，R-X- K–R↓占31.5%，R-X-X-R ↓为11%，其他特殊位点占16.4%[4]。前体蛋白Furin 裂解位点可以在the ProP server上进行预测评分。

2 弗林蛋白酶裂解位点在微生物感染宿主中的作用

微生物前体蛋白上的Furin 裂解位点主要作用是被宿主Furin 识别并裂解活化，从而使病原微生物进入细胞并发挥致病作用，但不同微生物中Furin裂解位点的作用和影响并不完全相同。宿主Furin参与识别切割HIV-1 囊膜糖蛋白gp160 的裂解位点；而Furin 抑制剂可以抑制gp160 裂解成gp41 和gp120，从而阻止HIV-1的感染[5]。

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）血凝素HA 和新城疫病毒（newcastledisease virus，NDV）融合蛋白F Furin 酶切位点不仅能够被宿主细胞识别切割，还与病毒毒力高度相关。H5 和H7 高致病性AIV HA 切割位点上游均含有多个碱性氨基酸，其最小结构正是Furin 识别的R-K-K-R↓；而低致病性AIV HA 裂解位点上游只有一个碱性氨基酸R[6-7]，只能被部分组织中的碱性蛋白酶切割，从而影响病毒毒力。NDV 典型强毒株融合蛋白F 的裂解位点也存在多个碱性氨基酸R/KRQR/KR↓，而所有弱毒株F 蛋白位点具有共性的序列RQGR↓，它符合Furin 底物特性，但其酶切效率可能较低，从而影响了病毒的毒力[8]。

在病毒组装过程中，由于部分β 属和所有γ 属冠状病毒S蛋白上存在Furin 裂解位点，因此能被宿主细胞高尔基体Furin 识别裂解为S1/S2。此外，MERS-Cov、SARS-Cov2 和IBV 等冠状病毒S 蛋白Furin 裂解位点变异和宿主与细胞嗜性相关。Yang等[9]发现MERS-Cov S 蛋白在748 位存在Furin 酶切位点（RSVR），而从蝙蝠上分离的与其同源性最高的HKU-4 S 蛋白缺失相应的酶切位点；人为引入突变S746位R 构成相应位置的酶切位点后，在无外源蛋白酶作用下H-Cov-HKU4 假病毒可以感染人体细胞；同时将MERS-Cov的Furin酶切位点突变替换成H-Cov-HKU4 S 蛋白相应的氨基酸后，MERSCov 的S 蛋白则完全失去活性。同样有研究发现，SARS-Cov2 S 蛋白上Furin 酶切位点PRRAR↓的引入可能成为其跨宿主传播的关键因素[10]。Yamada等[11]研究发现，IBV Beaudette vero 细胞适应株在S1/S2 之间Furin 裂解位点RRFRR↓下游产生了第2 个Furin 裂解位点HRRR↓；将S1/S2 之间的Furin 酶切位点缺失和突变为AAFAA 后，S1/S2 不能裂解，但病毒仍然能够在Vero 细胞中增殖并形成合胞体，细胞适应株产生的第2 个Furin 裂解位点可能与病毒适应Vero 细胞从而发生变异有关；目前鸡体天然分离IBV毒株不存在第二个Furin酶切位点，一般也不能在Vero细胞上生长。

Furin 裂解位点类型可能是病毒传播效率和规模影响因素之一。笔者通过对GenBank 中国内外400多个IBV 毒株S 蛋白的Furin 裂解位点统计分析发现：IBV 的裂解位点类型有40 多种；但分离数量多，流行规模大的优势毒株裂解位点主要有3个，包括RRFRR↓、RRSRR↓和HRRRR↓；而且这几种裂解位点类型符合Furin高效的切割规律。

3 总结与展望

虽然现有研究已经明确了部分病原Furin 裂解位点在微生物感染宿主的过程中的作用，如参与囊膜糖蛋白的裂解活化和病毒宿主膜融合、影响病毒毒力和跨宿主传播等。但不同病毒囊膜蛋白Furin裂解位点的作用和功能不完全相同，如AIV HA 蛋白和ND F蛋白与毒力相关，但IBV强毒分离株鸡胚传代致弱后，其S蛋白裂解位点类型没有发生变化，IBV 毒力与其S 蛋白裂解位点类型关系以及其他作用并没有明确。这有待于进一步深入研究，从而为揭示IBV 以及其他病毒入侵宿主细胞的致病机制、研制相应的阻断药物奠定基础[12]。