骨发育及损伤修复过程中骨形成与血管形成的偶联作用

胡灏 王任先 万奔 邹学农

骨组织是成分复杂的结缔组织，其无机成分占了干重的 65%，主要由羟基磷灰石结晶构成，这决定了骨的硬度；骨的有机成分占干重的 35%，主要由 Ⅰ 型胶原纤维构成，为骨组织提供了强大的韧性[1]。相比难以再生的心脏、脑组织等，骨组织具有极强的再生修复能力，这是因为其内外膜下以及骨髓腔内存在骨骼系统特异的干细胞或成骨前体细胞[2-3]。看似致密的骨组织实际上是血液供应非常丰富的组织，以长骨为例，较大的动脉由长骨中段穿过骨外膜，随后逐级分成细小的分支，通过骨组织中微小的管道，最终形成直径约为 5～10 μm 毛细血管床，滋养着藏匿骨中的骨细胞、干细胞、成骨细胞、破骨细胞等细胞组分[4]。

骨组织是功能活跃的组织，由成骨细胞与破骨细胞分别领导的成骨活动与破骨活动维持着骨的稳态。新骨的形成需要通过血管提供营养，旧骨分解代谢的产物同样需要通过血管的运输，骨组织中的血管为其稳态维持提供坚实的物质基础[5]。在骨的形成过程中，血管形成是不可或缺的重要环节，笔者将从骨发育以及骨损伤后修复两个角度对血管形成在骨形成中的作用进行概述，并从内皮细胞类型、细胞外生长因子、细胞内信号通路等多个层次阐述骨形成与血管形成的偶联作用机理。

一、骨发育中骨形成与血管形成的偶联

在胚胎发育的过程中，骨的形成有两种方式，即软骨内成骨和膜内成骨。对于大多数骨而言，尤其是长骨，骨的形成是以软骨内成骨的方式产生的，而少数的骨 (如颅骨、颌面骨与锁骨部分区域) 是通过膜内成骨的方式发生的。无论何种骨形成方式，骨的最初形态、轮廓都是由无血管的间充质细胞团构成，但其周围的疏松间充质组织内，许多毛细血管呈蓄势长入的状态，等待缺氧信号的号召。

1. 软骨内成骨与血管形成：软骨内骨形成大约发生在胚胎时期的 10.5 天，间充质细胞团通过增殖与有序排列获得了骨的初步几何形状。随着间充质细胞团向外扩张，中央区域的间充质细胞开始分化成软骨细胞。到了胚胎的 13.5 天，扩张至外周的软骨细胞由于接触到疏松间充质组织中的毛细血管开始分化为成骨细胞，形成一圈骨领结构，而中央区域的软骨细胞由于氧气与营养物质供应不足而肥大化[6]。肥大化的软骨细胞进一步发生凋亡，对血管长入以及后续的骨形成过程有着非常关键的调控作用。Gerber 等[7]发现，相比静息软骨细胞与增殖型软骨细胞，肥大软骨细胞内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 的表达量非常高，而其凋亡后，可在局部释放大量的 VEGF，作为强大的刺激因子，介导了血管内皮细胞的生长和血管的侵入。在这个过程中，血管经过骨领侵入间充质细胞团的中央区域，并将骨领中的成骨细胞以及循环血液中的单核 / 巨噬细胞带入其中。成骨细胞持续产生 Ⅰ 型胶原等细胞外基质，构成了初级骨化中心，而来到局部的巨噬细胞在将凋亡细胞清除后，可分化为破骨细胞，与成骨细胞一起进行骨的动态重 塑[8]。关于肥大软骨细胞内 VEGF 的表达升高的原因，有学者发现，间充质来源的细胞可以感受局部组织缺氧的信号，进而激活细胞内缺氧的信号通路，导致缺氧诱导因子 (hypoxia-inducible factor，HIF) 的表达升高，进而作为转录因子激活下游适应缺氧的相关基因的转录表达，其中就包括 VEGF 等多种促血管因子[9-10]。

2. 膜内成骨与血管形成：关于膜内成骨的研究大多是针对额骨和顶骨进行的[11]。以颅盖骨为例，起初间充质细胞团聚集，形成薄层穹顶样的形状，其基底部则围绕着有毛细血管的疏松间充质组织。随着间充质细胞团的扩张，其内可能存在缺氧因素而导致 VEGF 等促血管形成的因子分泌，这对基底部的疏松间充质组织中的毛细血管起到招募作用[12]。随着血管侵入，在缺氧状态改善的情况下，一部分间充质细胞分化成了成骨细胞。最开始血管侵入的部分随后成为了骨化的中心，随着间充质细胞团向外延伸，血管也呈放射状辐射出去。成骨细胞靠近血管分布，因而产生的胶原纤维及矿化骨质也从一个区域中心，呈放射状辐射出去，高分辨 CT 及双光子激光扫描显微镜的扫描研究证实了这一现象[13]。

相比于软骨内成骨，膜内成骨最大的特点是骨形成的过程中没有软骨细胞增殖、肥大化与凋亡的过程。而两种骨形成模式非常相似的一点是缺氧状态所导致 VEGF 的表达与血管侵入。相似中却有不同的是，有学者发现， HIF-2α 在两种骨形成方式中均存在，而 HIF-1α 仅仅在软骨内骨形成中被检测到[14]。Wang 等进一步的实验发现，增加 HIF-1α 的表达可以增加长骨的长度，而对颅骨并没有影响，这表明缺氧对两种骨形成方式的影响不是一致 的[15]。此外，许多研究发现，缺氧不是惟一的促进促血管形成因子表达的因素，在骨形成过程中升高表达的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)[16]以及成纤维生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)[17]也能上调 VEGF 的表达。

二、骨损伤修复与血管形成

在骨损伤修复的过程中，研究者们常采用分离性骨生成的模型来研究血管形成在其中扮演的角色[18]。在骨分离的最初阶段，分离区域由于组织炎症的影响产生了血肿包裹的纤维愈伤组织。当分离的拉力施加上时，中央形成了一个由纤维样细胞、软骨样细胞及中间形态细胞构成的无血管的中央纤维间区(Choi)。血管从两个骨折断端向中间长入，到达中央纤维间区两端而停止，形成平行于骨长轴的多条血窦，同时长柱状的类骨质也沿着血管产生。随着骨分离的停止，血管会长入中央纤维间区，并在成骨细胞与破骨细胞相互作用下完成骨的重塑[19]。在分离的骨中间，是血液供应的真空区域，这与骨发育过程的间充质团类似，缺氧的同时，坏死组织会释放 VEGF 等促血管生成因子招募血管的长入[20]。对分离性骨生成的大鼠模型施加血管形成抑制剂会导致骨不连，并且在分离的骨中间检测不到血管形成与骨形成的迹象[21]。这表明，在骨的损伤修复过程中，血管形成同样受到缺氧信号的调控，并对骨生成起到不可缺少的作用。而与骨发育过程不同的是，骨损伤区域的坏死组织还会产生许多炎症因子，其引发的免疫趋化效应会吸引许多免疫细胞到局部发挥功能，这提示免疫细胞可能在骨损伤修复过程中对成骨成血管偶联发挥重要调节作用[22]。

三、骨组织中的血管内皮细胞类型

许多证据显示，由于局部微环境不同，血管内皮细胞在不同组织中有不同的分化表型[23-24]。Kusumbe 等[25]发现，根据 CD31 表达的高低，骨组织中的血管内皮细胞可分为 CD31 高表达的 H 型和 CD31 低表达的 L 型。H 型血管内皮细胞分布在骨骺端和骨干段靠近密质骨的骨内膜区域，呈管束状排列，平行于骨的长轴，而 L 型血管内皮排列成网状，分布于骨干区域，二者在近生长板的区域相互交联。H 型血管的周围围绕着分泌 Ⅰ 型胶原的骨祖细胞，而在 L 型血管则包绕着造血干细胞，周围几乎没有骨祖细胞。通过比较衰老小鼠和青年小鼠骨中两种血管内皮的差异，发现衰老小鼠的 H 型血管内皮细胞数量随年龄增长显著下降，与骨量的下降呈相同趋势，而 L 型血管内皮细胞数量与青年小鼠没有显著差异。应用抗骨质疏松药物或促 H 型血管的药物进行治疗，可观察到骨组织的骨量和 H 型血管内皮细胞均显著增加[26-28]。以上实验表明了 H 型血管是骨形成和血管形成偶联机制的效应血管。

紧接着，Langen 等[29]使用流式细胞术进一步深入分析了胚胎 16.5 天、出生 0 天、6 天、14 天小鼠的血管内皮细胞表型，发现在 H 型血管中还可以分出一群高表达 Emcn 的 E 型血管。在胚胎 16.5 天，E 型血管所占比例非常高(56%)，出生后比例不断下降；H 型血管内皮细胞的比例则是先升后降，在出生后 6 天达到高峰，而随着年龄增大而下降；L 型血管所占比例随年龄持续增加。基因表达谱系分析发现，E 型血管内皮细胞可能是 H 型血管内皮细胞的祖细胞，而一部分 H 型血管随着年龄增长又演变成了 L 型血管。尽管研究表明 E 型血管内皮细胞可能是其它两类内皮细胞的祖细胞，但它的特性、定位以及功能还需要进一步的研究。这也提示在组织工程的研究中，特异性地筛选 H 型血管参与组织构建，增强组织血管形成能力，或将成为新的研究趋势。

四、在骨形成与血管形成偶联中发挥作用的细胞因子

在过去的研究中，被提到最多的、并且被认为最重要的影响骨形成与血管形成偶联的细胞因子即为 VEGF[20,30]。其 VEGF-A 亚型是调控血管形成的主要因子，由于血管内皮细胞为血管形成过程中的细胞执行者，它的表面有血管内皮生长因子受体 R2，当二者发生结合，引发的信号会促进血管内皮细胞的迁移与增殖。在软骨内成骨的过程中，由于软骨细胞缺氧而发生肥大化，进而分泌大量 VEGF-A，周围已存在的血管网便迅速发生新生血管，侵入软骨中，引发骨的形成过程。当抑制 VEGF 活性时，由于血管的侵入受到抑制，肥大的软骨细胞区域出现代偿性扩大(为了产生更多的 VEGF)。随后，有研究对 VEGF 的治疗效果进行验证，发现无论是在软骨内成骨还是膜内成骨过程中，应用 VEGF 能强化血管形成与骨形成的能力[30-31]。

血小板衍化生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF) 是间充质来源细胞的一种潜在丝裂原，在血管形成过程中发挥重要作用。Xie 等[32]的研究表明，前破骨细胞分泌的 PDGF-BB 能促进血管形成，并与骨形成的过程发生偶联。前破骨细胞敲除 PDGF-BB 后，小鼠的骨量明显下降，同时 H 型血管和正常小鼠比也明显减少。在骨质疏松小鼠模型中，血清和骨髓中的 PDGF-BB 以及 H 型血管都是明显减少的，而使用外源性的 PDGF-BB 可以增加 H 型血管并刺激骨质疏松小鼠的骨形成。在骨形成的过程中，前破骨细胞是血管侵入后进入骨中的，而它分泌的 PDGF-BB 能够促进 H 型血管的生成，这表明血管生成在骨生成过程中存在一个正反馈的机制。全身应用 PDGF-BB 早已被证实能促进骨质疏松大鼠的骨密度[33]，而将 PDGF-BB 结合生物材料植入大鼠颅骨缺损可以获得很好的骨修复效果[34]。在人类临床试验研究中，人重组 PDGF-BB 与修复支架联合局部应用，可以促进牙槽骨生成与填充，提高临床附着水平(clinical attachment level，CAL)[35]。

一项针对新西兰大白兔骨缺损治疗的研究中，比较了单独应用 VEGF 与含有多种因子(VEGF、PDGF、转化生长因子、表皮生长因子等) 的血小板基质的疗效，结果显示，相比单用血管生长因子，多种因子的共同作用可以获得更佳的骨修复效果[36]。如何进一步筛选出最优的细胞因子组合、配比，以增强骨修复、降低副作用，对于将研究成果推向临床至关重要。

五、Notch 信号通路在骨生成、血管生成偶联中的 作用

Notch 信号通路是一条在进化上高度保守，影响细胞增殖、分化和凋亡的信号转导途径，可通过介导细胞间相互作用调控胚胎发育、组织更新和肿瘤发生[37]。在胚胎发育、小鼠视网膜或肿瘤中，Notch 信号被认为是负面调控血管生成的[38]，抑制内皮细胞 Notch 信号的激活可引起内皮细胞增殖和大量出芽，导致软组织的过度血管化。然而，在出生后的长骨中，Notch 信号是促进内皮细胞增殖与血管生成的，这与其在其它器官与肿瘤中的作用相 反[39]。内皮细胞特异性的 Notch 信号通路扰乱不仅损害血管形态和生长，而且会造成骨形成的减少，长骨长度缩短，软骨细胞缺陷，皮质骨丢失以及骨量减少。抑制 Notch 信号中的一个重要介导基因 Rbpj，出生后小鼠的骨中 H 型血管以及长骨中增殖的内皮细胞明显减少。而通过表达 Fbxw7 基因来加强 Notch 信号通路的作用，可发现尽管小鼠视网膜血管生成减少了，但是小鼠骨中增殖内皮细胞含量更多了，同时骨量也有显著的提高[40]。另外，Notch 信号也会影响 VEGF 及其受体的表达，抑制 Notch 信号导致 VEGF 受体 1、2、3 均下调。相反，强化 Notch 信号会导致上述受体的表达增加。进一步研究发现，这些骨骼缺陷与内皮细胞 Noggin 自分泌不足有关。Noggin 作为 BMPs 的抑制剂，由 Notch 信号调控内皮细胞分泌，能促进肥大软骨细胞的生成。这些研究表明，Notch 在骨中的血管生成发挥着重要的正性调控作用，与其在其它器官中发挥抑制性的功能完全不同。骨微环境的特别之处在于内皮细胞与成骨细胞、破骨细胞及免疫细胞有密切的接触与交流，Notch 信号对内皮细胞的抑制作用是否来源于上述细胞的负反馈信号，非常值得深入的研究。

六、小结与展望

血管作为运输氧气、营养物质、代谢废物的器官，几乎在所有组织器官的发育及损伤后修复过程中发挥重要作用。但是，血管生成在骨组织中有多层次的独到之处。首先，根据血管内皮细胞 CD31 及 Emcn 的表达，在骨组织中的血管内皮细胞可分为 E 型、H 型、L 型：E 型血管内皮可能为后两者的祖细胞，H 型血管与骨祖细胞在空间上紧密相接，在骨形成过程中承担血管生成的作用，而 L 型血管与造血干细胞的关系更为密切[41]。其次，缺氧-HIFVEGF 的调控轴是血管化的主要刺激因素[42]，但是在软骨内成骨与膜内成骨中，缺氧的重要性与表象又有不同。此外，在骨组织中，调控血管生成的信号通路又是非常特别的，与其它器官中 Notch 信号通路的抑制性调控不同，骨组织中 Notch 信号正向调控血管生成，并与骨形成的过程相偶联。

在骨的发育或者是损伤后的修复过程中，血管形成先于骨形成，是必不可少的环节，以促血管生成为思路的治疗手段在骨质疏松或骨缺损，在动物模型中取得了很好效 果[43-44]，如果进一步将该理念应用于临床研究，将带来新的研究热点与研究机遇。此外，新一代的骨修复材料需要被赋予更强大的生物活性，对于骨修复材料的生物学评价而言，将促血管生成的能力纳入评价体系更有利于筛选出与体内环境适配的新型骨修复材料。

尽管研究人员对于骨形成与血管形成的偶联作用有了较为清晰的认识，但仍然有一些悬而未决的科学问题需要深入的研究。比如，在长骨发育过程中，血管的长入让大部分间充质团经历了软骨内成骨的过程，而长骨两端却始终维持无血管的透明软骨状态，其抑制成骨与成血管偶联的机制是什么尚无定论。现阶段关于成骨成血管调控的分子机制仍不完善，本课题组前期的研究发现，间充质干细胞中 miR-140-5p 的上调和 miR-146b 的下调分别通过靶向 VEGFα 和 Smad4 抑制血管化，进而维持软骨表型[45]。在此笔者提出，当发育或者组织损伤的信号出现时，包括 microRNA 在内的多种表观遗传调控机制对成骨成血管偶联的过程进行精妙的正向与反向调控。深入探究血管形成和骨形成偶联过程中的表观遗传机制将有助实现对骨发育和修复过程的精准调控，最终为骨质疏松、骨肿瘤等多种骨软骨相关疾病的治疗提供新的思路与手段。