环状RNA在肝纤维化中的作用机制研究进展

叶志荣，林晖，缪辉来

(广东医科大学附属第二医院肝胆外科，广东 湛江 524023)

环状RNA(circular RNA，circRNA/circ)是一类由外显子或外显子-内含子经共价键连接而成的环形非编码RNA，最初被认为是错误剪辑的废弃产物，随着对非编码RNA研究的深入，circRNA的生物学功能也逐渐被发掘。由于circRNA没有5′端帽子和3′端poly(A)尾巴，其序列高度保守，且结构稳定；此外，circRNA可充当微RNA(microRNA，miRNA/miR)的分子海绵，竞争性抑制miRNA，从而调控下游基因和蛋白的表达，这些特征及生物学功能使circRNA成为继小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)、miRNA和长链非编码RNA(long non-cording RNA，lncRNA) 之后的又一研究热点[1]。目前关于circRNA的研究主要集中于生物标志物和miRNA海绵调控作用，但随着对circRNA研究的深入，发现其在兔网织红细胞系统等特定条件下可翻译蛋白并发挥细胞调节功能，这一发现颠覆了人们对circRNA是非编码RNA的认知，为circRNA的研究开辟了新方向[2]。肝纤维化是肝损伤常见的病理转归，但肝纤维化的修复及逆转机制目前尚不明确。有证据表明，circRNA与肝纤维化等相关疾病的发生发展密切相关[3]。现就circRNA在肝纤维化中作用机制的研究进展予以综述。

1 circRNA的生物学功能

1.1翻译蛋白 Abe等[2]参考聚合酶链反应的滚动扩增技术，将含有无限开放阅读框的circRNA在无细胞的大肠埃希菌翻译系统中成功翻译成蛋白质。为了证明细胞中circRNA的翻译功能，研究者合成了含有标签序列的circRNA，并分别转染至兔网织红细胞系统和HeLa细胞系中，通过免疫荧光染色及蛋白质印迹法检测证实，在活细胞内即使无内部核糖体进入位点序列、polyA尾或帽结构，circRNA分子仍可顺利翻译成蛋白质并发挥功能[4]。circRNA翻译功能的发现为circRNA研究提供了新的思路。研究发现，circRNA含F-框WD重复域蛋白7基因编码一个新蛋白含F-框WD重复域蛋白7-185aa，可抑制胶质母细胞瘤细胞增殖[5]；肝癌细胞中的circRNA β联蛋白(β-catenin)翻译产生一种同工型蛋白β-catenin-370aa，可激活Wnt/β-catenin信号通路，促进肝癌细胞的生长[6]。

1.2作为miRNA海绵 与线性RNA相比，circRNA结构稳定性更好，可在人体血液、唾液等体液中分泌表达，并在不同位置表现出特异性。研究发现，circRNA含有许多miRNA结合位点，因此可阻断或降低miRNA抑制基因的作用，这种抑制作用是指circRNA通过其种子序列与信使RNA的3′非翻译区以碱基配对的形式结合，进而抑制信使RNA翻译或促进信使RNA降解[7-8]。RNA的海绵作用是指circRNA作为竞争性内源RNA对靶基因的表达进行调节。circRNA与碱基互补配对的miRNA竞争性结合，以海绵样吸附作用降低miRNA丰度，同时抑制其表达，从而调控miRNA下游靶基因和蛋白的表达，影响细胞的功能及相关疾病的发生发展。在肝癌细胞中，circRNA同源结构域相互作用蛋白激酶3海绵样结合miR-124，并通过抑制miR-124丰度上调水通道蛋白3的表达，促进肝癌细胞的增殖和迁移[9]；在二氧化硅诱导的肺纤维化疾病中，circRNA小脑变性相关蛋白1反义转录物作为miR-7海绵竞争性抑制miR-7，并通过下游miR-7/转化生长因子-β2信号通路促进肺纤维化的形成[10]；Wang等[11]证实，circRNA MTO1(mitochondrial tran-slation optimization 1)可通过结合miR-17-5p上调Smad7的表达。另外，mmu_circ_42398可通过结合miR-338-3p上调BMP激活素膜结合抑制因子同源物的表达，抑制Smads蛋白的磷酸化水平，进而通过调控转化生长因子-β1/Smad信号通路抑制肝纤维化的进展[12]。

1.3调控基因转录 有研究发现，circRNA在基因调控过程中发挥重要作用[13]。随着生物信息和基因测序技术的发展，circRNA在基因调控过程中的作用逐渐明确，相关基因转录和翻译的大规模数据已成为科研人员研究基因调控的重要资源和依据。一些circRNA通过调控基因转录过程中的关键环节发挥生物学功能。如RNA聚合酶Ⅱ相关的circRNA真核翻译起始因子3J和circRNA多聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白2在HeLa细胞和HEK293细胞核中作为顺式作用元件调节其亲本基因的表达；circRNA真核翻译起始因子3J和circRNA多聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白2还可通过与U1 snRNA特异性RNA-RNA相互作用生成U1 snRNA复合物，然后cirRNA cRNA-U1 snRNA复合物在亲本基因启动子上进一步与RNA聚合酶Ⅱ转录复合物结合，达到刺激转录和增强基因表达的目的[14]。

1.4调节蛋白功能 除了调节基因转录和翻译，circRNA还可作为适配器调节蛋白之间的相互作用和蛋白的活性。Du等[15]研究发现，circRNA叉头框转录因子O3(forkhead box O transcription factor 3，FoxO3)在小鼠乳腺癌4T1细胞系和黑色素瘤B16细胞系中均特异性低表达，并作为适配器连接细胞周期蛋白依赖性激酶2和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21，通过形成circRNA Foxo3-p21-细胞周期蛋白依赖性激酶2三元复合物抑制细胞周期蛋白依赖性激酶2的功能，从而延缓细胞周期进程。此外，circRNA FoxO3还可同时结合p53和鼠双微体2基因，在鼠双微体2基因调节p53的多聚泛素化功能中起双重调节作用，过表达circRNA FoxO3可显著抑制鼠双微体2基因多聚泛素化功能，促进细胞凋亡[16]。

2 circRNA在肝纤维化中的作用

2.1circRNA与肝纤维化形成机制 circRNA是非编码RNA领域的研究热点之一，在揭示疾病发病机制、探究诊断标志物及治疗靶点等方面均取得了一定进展[17]。有研究发现，circRNA与原发性肝癌、脂肪肝等慢性肝脏疾病相关[18]。有研究指出，可将circRNA作为诊断原发性肝癌的主要标志物之一[19]。另外，circRNA还与肝纤维化的发生发展相关[18]，但关于其具体机制的研究较少。肝纤维化是肝脏损伤和修复过程中产生的病理现象。肝纤维化主要由细胞外基质和α-平滑肌肌动蛋白过量沉积导致，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)在损伤的刺激下转化为肌成纤维细胞是细胞外基质的主要来源。因此，HSC的激活是肝纤维化的必要条件，HSC也是目前公认的肝纤维化关键细胞[20]。激活的HSC可分泌成纤维细胞生长因子、基质金属蛋白酶等细胞因子，调节肝纤维化进程[21]，并释放富含circRNA等信号分子的细胞外囊泡，调节邻近的肝细胞及肝窦内皮细胞，甚至驱动静息状态的HSC活化，促进肝纤维化的发生发展[22]。

此外，circRNA还可通过miRNA海绵功能调控HSC的功能及状态，从而介导肝纤维化的发生和进程。Zhu等[23]报道，胸腺素β4通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路在HSC中发挥抗肝纤维化作用，利用基因芯片检测胸腺素β4缺失HSC中circRNA的差异表达发现，circRNA-0067835显著上调，而敲除circRNA-0067835则可显著抑制HSC的增殖并促进其凋亡；进一步研究发现，circRNA-0067835具有miR-155海绵功能，其可通过竞争性抑制miR-155上调Foxo3a和蛋白激酶B的表达，证实circRNA-0067835可通过miR-155/FoxO3信号通路介导胸腺素β4的抗肝纤维化作用。Ji等[24]研究发现，在小鼠肝损伤模型和转化生长因子-β1激活的人HSC细胞模型中hsa_circ_0070963的表达均显著下调，并证实hsa_circ_0070963作为miR-223-3p海绵可通过miR-223-3p/LEMD3(LAP2-emerin-MAN1 domain-containing protein 3)信号通路抑制HSC的活化，进而抑制肝纤维化的发生。表明circRNA可调节肝纤维化关键细胞HSC的活化与功能，因此可作为抑制HSC活化的治疗靶点，促进肝纤维化的逆转。

2.2circRNA与各种肝病引起的肝纤维化 肝细胞纤维化和早期肝硬化均可通过早期干预逆转，因此尽早治疗可显著降低肝衰竭风险、改善患者预后[25]。目前肝纤维化的早期诊断存在创伤大、特异性差等问题，因此寻找肝纤维化的特异性标志物和治疗靶点对肝病治疗具有重要意义。2017年，Chen等[26]首次报道了circRNA与HSC活化有关，该研究采用基因芯片技术分析了放射线诱导的人HSC LX-2细胞活化模型的circRNA差异表达谱，并证实hsa_circ_0071410可特异性结合miR-9-5p，通过miRNA海绵作用影响HSC的活化水平。Wang等[11]研究发现，患者体内血清circRNA MTO1水平与肝纤维化的进展呈显著负相关，且体外HSC细胞活化实验模型进一步证实，circRNA MTO1可通过结合miR-17-5p上调Smad7的表达，从而抑制肝纤维化的进展。另外，Zhu等[23]研究发现，circRNA-0067835可通过调节miR-155/Foxo3信号通路影响HSC的活化。以上研究均表明，部分circRNA可影响肝纤维化进展中的关键环节——HSC活化，但circRNA与肝纤维化的关系及具体机制仍需进一步研究。

2.2.1circRNA与病毒性肝炎 病毒性肝炎是目前我国最常见的肝脏疾病，也是肝纤维化最主要的原因之一。早期病毒性肝炎虽无明显症状，但持续、轻微的炎症损伤累积可导致肝硬化和肝细胞癌，目前丙型病毒性肝炎的根治率约90%，而乙型病毒性肝炎尚无根治手段，全球每年约有85万人死于乙型病毒性肝炎继发的肝损伤疾病[27]。Wang等[11]在慢性乙型肝炎患者血清中发现差异表达的circRNA MTO1，且circRNA MTO1的表达与纤维化分期及Knodell组织学活动指数呈负相关，结合circRNA特性，circRNA MTO1具有成为肝纤维化新诊断标志物的潜力；进一步研究发现，circRNA MTO1还参与了转化生长因子-β1激活HSC的过程，并作为miR-17-5p海绵抑制miR-17-5p及下游Smad7的表达，进而抑制慢性乙型肝炎相关的HSC活化和肝纤维化的发生发展。国外一项研究参照Miravirsen的锁核酸修饰反义寡核苷酸技术人工合成了一个circRNA分子，并将其作为miR-122分子海绵，结果发现，该circRNA不仅可下调miR-122的表达，还可与丙型肝炎病毒增殖所需的宿主因子hnRNP L等结合，甚至可以与丙型肝炎病毒蛋白结合，阻断其增殖和传播[28]。由此可见，circRNA可能成为各种病毒性肝炎肝纤维化的诊断标志物和治疗靶点。

2.2.2circRNA与酒精性肝病 乙醇是化学性肝损伤的首要因素，酒精性肝病是仅次于病毒性肝炎的第二大肝硬化致病原因。目前针对酒精性肝病的治疗方法较少，主要以戒酒和保肝治疗为主，对于严重酒精性肝炎患者，应用糖皮质激素是目前降低患者病死率的唯一有效疗法[29]。有学者发现，乙醇喂养小鼠肝脏库普弗细胞中circ_1639表达上调，而过表达circ_1639可通过miR-122海绵作用调节下游人肿瘤坏死因子受体超家族成员13C的表达，从而激活核因子κB信号通路，而敲低circ_1639表达则可降低酒精性肝病的炎症反应及纤维化程度，为酒精性肝病及其继发的肝纤维化提供新的治疗靶点[30]。

2.2.3circRNA与药物性肝损伤 肝脏是药物代谢的重要场所，药物性肝损伤是临床药物治疗最常见的不良反应之一。Shen等[31]对我国308所医院25 927例药物性肝损伤确诊患者的回顾性分析发现，我国药物性肝损伤的发生率较高，其中药物危害最严重的是传统中药制剂和抗结核药，其主要通过引起药物损伤性肝纤维化导致患者因肝硬化和肝衰竭死亡。Li等[32]利用过氧化氢诱导的肝细胞损伤模型研究发现，circRNA-4099与miR-706在受损肝细胞中相互调节，circRNA-4099通过触发Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1/核因子E2相关因子2和p38促分裂原活化的蛋白激酶信号通路抑制miR-706的表达，从而促进过氧化氢诱导的肝细胞凋亡，导致肝纤维化。

2.2.4circRNA与放射性肝损伤 放射性肝损伤是肝癌放疗的常见并发症，也是胸部和上腹部放疗最严重的并发症[33]。放射性肝损伤常伴随circRNA的异常表达，表明circRNA可能参与肝细胞对辐射的反应和纤维化过程。circRNA可通过抑制或减弱相关基因的表达，减弱辐射诱导的HSC活化，辐射损伤主要通过刺激HSC活化引起纤维化物质及炎症因子释放，导致持续的瘢痕形成和炎症损伤，从而引起肝纤维化，进而导致肝大和腹水等严重症状；另外，在辐射和脂多糖刺激诱导下，人HSC LX-2细胞中circRNA TUBD1(tubulin delta 1)的表达显著升高，而通过小干扰RNA敲除circRNA TUBD1的表达则可抑制LX-2细胞增殖并促进其凋亡，同时显著降低辐射和脂多糖损伤的LX-2细胞中炎症因子的水平；circRNA TUBD1还可作为miR-146a-5p海绵，通过Toll样受体4信号通路调控HSC的激活，从而参与辐射对肝细胞的损伤和纤维化过程[34]。Chen等[35]发现，在辐射损伤的HSC LX-2细胞中，circRNA重构剪切因子1与miR-146a-5p海绵样结合，通过增加下游Ras相关的C3肉毒素底物1的表达增强受损LX-2细胞的活力和肌成纤维细胞表型转化，促进炎症因子和α-平滑肌肌动蛋白释放，加重肝纤维化。以上研究均表明，circRNA参与调节辐射损伤的HSC活化和纤维化物质释放，为放射性肝损伤中肝纤维化的治疗提供了新方法。

2.2.5circRNA与非酒精性脂肪性肝炎 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，而非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是NAFLD的关键阶段，若治疗不及时可导致肝硬化、终末期肝病与肝细胞癌[36]。NAFLD的发病机制目前尚不明确。circRNA与NAFLD及肝再生机制相关[37]。在NASH发病机制的研究中，研究者首先通过基因芯片技术检测小鼠NASH模型，检测出可同时促进circRNA与抑制信使RNA表达的miRNA——miR-122，然后利用circRNA、miR-122和信使RNA随机组建4组circRNA-miRNA-信使RNA网络，最后通过研究4组circRNA-miRNA-信使RNA网络对肝损伤的影响，发现NASH的发生发展与circRNA密切相关，提示circRNA有成为NASH治疗靶标的潜力[38]。另有研究发现，传统中医强肝药方可显著改善NASH患者的症状，研究者用强肝药方提取物喂养小鼠并建造模型，高通量测序结果表明，小鼠肝脏中的circ_0007379表达显著上调，而circ_004572表达下调，可能与强肝药方治疗NASH的机制相关[39]。

3 小 结

肝纤维化发病机制复杂，目前临床尚无理想的治疗方法。随着生物学技术的发展，circRNA对肝纤维化的调节作用不断被发现。多种circRNA均参与了肝纤维化关键细胞HSC的增殖与活化水平的调节，并发挥了重要的生物学功能。目前针对circRNA生物学功能的研究主要集中于miRNA海绵功能，对circRNA的转录和调控蛋白表达等生物学功能的研究仍处于起步阶段，还有待进一步研究阐明。未来，结合circRNA的特性对肝纤维化发展过程深入探索，可为肝纤维化的研究提供新方向，且随着研究的深入，RNA干扰技术将为肝纤维化的治疗提供新思路。