前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9及其抑制剂在动脉粥样硬化中的作用研究进展

崔朝初，卢 娜，冯超丽，杨建波，郭志坤，王现伟

(新乡医学院基础医学院，河南省医用组织再生重点实验室，河南 新乡 453003)

随着预防和治疗手段的不断提升，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的致死率逐渐降低，但其在全球范围内仍然严重威胁着人类的生命健康[1]。血液中的低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)是促进AS发生、发展的最主要的因素之一[2]。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是一种可溶性的分泌型丝氨酸蛋白酶，其能通过多种途径调节LDL-C相关的生理活动，如PCSK9可以促进低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)的内吞和降解，从而抑制LDLC从血液中的清除。PCSK9还能上调凝集素型氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1)的表达，促进巨噬细胞摄取氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxidized LDL-C，ox-LDL-C)而形成泡沫细胞。因此，PCSK9是治疗低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)介导的AS的重要靶标[3-5]。目前，靶向PCSK9的抑制剂的研究和应用已经取得了可喜进展，如Avelumab和Evolocumab已经在临床上应用于AS的治疗，此外还有多个抑制剂处在临床前或临床试验的研究中，并表现出强大的潜力[3,6-10]。本文主要综述PCSK9的分子调节机制及其在AS中的作用，以及靶向PCSK9的抑制剂的研究现状，旨在为靶向PCSK9药物的研发和临床应用提供参考。

1 AS的发病机制及LDL-C在AS中的作用

AS属于慢性炎症性疾病，是心肌梗死等心脑血管疾病的主要诱因[1]。高血脂、高血压、高血糖和肥胖等因素均能诱导AS，这些因素常会诱导炎症反应和氧化应激，并进一步引起相关离子紊乱、脂质沉积、血管平滑肌细胞增殖和细胞泡沫化等病变，从而诱发和促进AS[11-14]。

血液中的LDL-C可以通过损伤的内皮细胞(endothelial cell，EC)进入血管内膜。LDL-C被氧化成ox-LDL-C后，会进一步导致血管EC的损伤，从而形成一个恶性循环。此外，血管EC还能分泌黏附分子，导致炎症细胞在受损处的聚集[15]，因此，AS病灶总是伴随着高水平的核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)样受体家族蛋白3(NOD-like receptors family protein 3，NLRP3)。血管平滑肌细胞和免疫细胞也可以从血管腔和血管外膜侧入侵血管壁。巨噬细胞通过细胞膜上的清道夫受体(scavenger receptor，SR)识别并吞噬LDL-C，从而形成泡沫细胞并合成蛋白聚糖、胶原和弹力蛋白。如果这些细胞或者细胞外基质不能被及时清除，则会在EC下层形成脂质纹或斑块。而斑块(尤其是纤维帽)的破碎是AS诱发急性心血管疾病的主要因素[13,16-18]。

2 PCSK9的作用及其活性调节机制

自从发现PCSK9与脂质代谢紊乱有关后，PCSK9迅速成为治疗AS的研究靶点[19-20]。PCSK9主要在肝脏内合成并释放至血液循环中。尽管肾脏、肠道、巨噬细胞和EC中也能合成少量的PCSK9，但这类PCSK9可能主要是用于自分泌或在细胞内部起作用[4,21-23]。PCSK9的结构含有信号肽、前体结构域、催化结构域和羧基末端结构域。PCSK9酶原(相对分子质量74 000)自我催化裂解并释放出前肽(相对分子质量14 000)，产生成熟的PCSK9(相对分子质量60 000)并分泌至细胞外。PCSK9具有多种生物功能，可以调节血浆脂质稳态、肝再生、胰岛素分泌、神经发育以及肿瘤的免疫特性等。现已证实，PCSK9在动脉斑块、心肌缺血、心肌梗死等心血管疾病中均起重要作用[10,24-25]。

PCSK9的表达受到包括炎症因子、微RNA(microRNA,miRNA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、线粒体DNA和非编码RNA等多种因素的调节。转录因子叉头框蛋白O3(forkhead box O3，FOXO3)/肝细胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α)、胆固醇调节元件结合蛋白-1/2(sterol regulatory element-binding protein-1/2，SREBP-1/2)均能够促进PCSK9的转录。而miR-483-5p和成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)可抑制PCSK9的表达[21,26-28]。

PCSK9的活性不仅依赖于其表达水平，还与其突变形式、剪切体形式以及翻译后的修饰密切相关[19,29-31]，如PCSK9的 S127R和F216L突变为功能获得型突变，Y142X和C679X突变为失活型突变[19-29]。PCSK9还存在一种相对分子质量为55 000的剪切体，且活性相对较低。此剪切体来源于细胞外弗林蛋白对已被分泌至细胞外的成熟的PCSK9的剪接。如果在细胞内人为地过表达此剪切体，则其不能被分泌至细胞外，但仍能够发挥降低LDLR的作用，其活性低于相对分子质量为60 000的PCSK9[32]。

PCSK9的翻译后修饰包括天冬酰胺(Asn533)的糖基化、酪氨酸(Tyr38)的硫化以及丝氨酸(Ser47/Ser688)的磷酸化等方式。PCSK9的磷酸化不仅能增强其与LDLR中表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)AB结构域的结合能力，还能上调PCSK9的分泌[30]。最近，有研究发现了3个新的内源性的能够与PCSK9相互作用的蛋白，分别为A1AT、APOH和AMBP，其中A1AT 可能是PCSK9的内源性抑制蛋白，而APOH和AMBP对PCSK9的作用还有待进一步研究[33]。PCSK9还含有膜联蛋白A2(annexin A2，AnxA2)、硫酸肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPG)和环化酶相关蛋白1(cyclase-associated protein 1，CAP1)等分子的结合位点。AnxA2能够抑制PCSK9介导的LDLR的降解作用，HSPG结合PCSK9后能促进PCSK9-LDLR复合体的形成，而CAP1则诱导PCSK9/LDLR 复合体进入caveolae依赖的内吞过程。因此，硫酸类肝素类似物或针对HSPG结合位点以及CAP1等分子结合位点的抑制剂都是潜在的PCSK9调节剂[31,34-35]。

3 PCSK9在AS中的作用

ABIFADEL等[19]研究发现，PCSK9的2个功能获得型突变(S127R和F216L)与家族性胆固醇疾病有关[19]。还有研究发现，PCSK9的2个功能缺失型突变(Y142X和C679X)会降低血液中约40%的LDL-C[29]。LDL中的ApoB100结合LDLR形成复合物后，通过网格蛋白小窝蛋白介导的内化作用进入细胞，随后在酸性环境条件下，LDLR脱离复合物并重新返回到细胞膜上发挥作用，而LDL则在细胞内被降解，这是LDL从血液中被肝脏清除的主要方式之一。细胞外的PCSK9可通过其C端与细胞膜上LDLR的细胞外EGF-A结构域结合而形成复合物，通过网格蛋白小窝蛋白介导的内化作用进入细胞。在酸性环境中，PCSK9与LDLR的结合作用进一步增强，最终PCSK9与LDLR在溶酶体被降解。这抑制了LDLR从内体到细胞膜的再循环过程。细胞膜上LDLR的减少导致肝脏清除LDL-C的能力减弱，因而血液中LDL-C水平升高。尽管PCSK9在细胞内也能直接结合LDLR，但PCSK9主要是通过分泌至细胞外结合并促进LDLR的降解[36-38]。此外，硫化氢能够抑制PCSK9的表达，导致前体LDLR蓄积。这表明PCSK9不仅能促进LDLR的降解，也参与了LDLR蛋白的成熟过程[39]。

PCSK9还能够激活血小板并促进肾上腺素诱导的血小板的聚集和血栓的形成[40-42]。PCSK9还可调控炎症反应，促进多种促炎因子的表达，例如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-10和Arg1[33,43]。PCSK9的水平升高还能够增强巨噬细胞对LDL-C的吞噬和泡沫细胞的形成，从而促进AS的发生、发展[44]。NLRP3炎症小体的激活能够通过IL-1β上调AS斑块中巨噬细胞和局部组织中PCSK9的分泌。因此，炎症反应和PCSK9之间形成正反馈循环，进一步恶化AS[45-46]。

4 PCSK9抑制剂在AS中的研究进展

由于PCSK9与LDLR的结合区域较小且平滑，导致靶向PCSK9抑制剂的研发难度较大。研究发现，PCSK9酶原的成熟过程可能与其 366～383发卡结构的开放有关，通过靶向上述发卡结构，可以干扰PCSK9与LDLR的相互作用，从而达到降低血脂水平的效果[47]。当处于有序状态下，PCSK9的P′ helix被包裹在PCSK9的催化结构域中。而P′ helix结构域能够从α螺旋转换为非有序结构，从而与化合物结合。因此，此结构域也有望成为潜在的PCSK9抑制剂作用靶点[48]。早期的PCSK9抑制剂主要基于PCSK9与LDLR相互作用位点来设计，包括LDLR EGF-A或EGF-AB结构域类似的蛋白或多肽、重组LDLR片段或者抗体[49]。此外，反义RNA、小干扰RNA(smal interfering RNA,siRNA)等基因干预手段和天然产物等也逐渐成为研究PCSK9抑制剂的热点。

4.1 蛋白类抑制剂

4.1.1 单克隆抗体单克隆抗体主要是通过其结合PCSK9后干扰PCSK9与LDLR的相互结合而发挥作用，比如目前处于临床试验1期的Ralpancizumab和MEDI4166[50-51]，处于临床试验2期的MPSK3169A和LY3015014[52-53]，处于临床试验3期的IBI306(临床试验编号：NCT04031742)和AMG145[6]，以及已经上市的Avelumab 和Evolocumab[3,8]。Avelumab和Evolocumab对沙坦类或其他类降脂药物不敏感的患者同样有效，且已被证实能够有效降低心肌梗死和中风等多种AS相关的心脑血管疾病的发病率[8]。而Bococizumab因其较强的免疫原性以及中和抗体的产生导致疗效逐渐下降，被终止于3期临床[54]。中国科学家研发的靶向PCSK9的单克隆抗体IBI306具有可以间隔较长时间给药的优点，目前已经进入2/3期临床试验。此外，还有针对PCSK9的C末端结构域设计的抗体，在临床前研究中也表现出了较好的效果，但其作用机制还有待进一步研究[35]。靶向PCSK9的C端富含半胱氨酸和组氨酸的结构域的抗体不影响PCSK9与LDLR的结合，但其可以将PCSK9滞留在内质网，减少了PCSK9的分泌，从而达到降低血脂的效果[55]。

4.1.2 非抗体类蛋白药物此类药物包含普通肽类和类抗体支架蛋白药物。SX-PCK9是PCSK9片段类似物，其与类抗体支架蛋白药物BMS-962476、LIB003、Pep2-8和DS-9001a均是通过结合PCSK9而抑制PCSK9与LDLR相互作用[37,56-57]。类抗体支架蛋白药物的作用原理类似于抗体与靶部位结合，但与传统的抗体相比，其具有分子质量更小、结构更加简单和更易穿透组织的特点[58]。BMS-962476是由相对分子质量11 000的多肽与聚乙二醇共轭连接组成。连接聚乙二醇是为了增强其药物代谢动力学的特性[59]。LIB003是由含有PCSK9结合位点的类抗体与人血清白蛋白组成的融合蛋白，其相对分子质量为77 000，且非常稳定。临床试验证实，LIB003在有效的剂量下比较安全且耐受性较好。目前LIB003已经进入3期临床试验[60]。

4.1.3 疫苗由于大多数外源性单克隆抗体价格昂贵，导致患者的使用成本较高。为了克服上述困难，研究人员开发了针对PCSK9的疫苗，包括PCSK9Qβ-003、AT04A和AT06A[61-63]，AT04A和AT06A在动物实验中能够诱导强烈且持久的免疫反应，产生靶向PCSK9的抗体，从而抑制PCSK9与LDLR的作用，且目前已经开始1期临床试验。其中AT04A表现出较好疗效，能够显著降低血液中的脂质水平、血管炎症以及AS病灶的大小和数量，且无明显不良反应[61-62]。

4.2 小分子化合物抑制剂PF-06446846和PF-00932239(R-IMPP)为靶向PCSK9的口服小分子化合物，其能诱导80S核糖体延宕。PF-06446846能够选择性抑制PCSK9在核糖体的翻译合成，达到降低血脂效应[64-66]。PF-06815345可被羧酸酯酶1转换为两性离子活性药物，通过非80S核糖体依赖性的方式导致PCSK9合成减少[66]。NYX-330、DRP、Nilotinib类及新近报道的一系列靶向PCSK9的环状四聚体小分子化合物均可抑制PCSK9与LDLR之间的作用[7,10,36-37，67]。环状四聚体小分子化合物作用于PCSK9的半数抑制浓度均小于1 nmol·L-1。但其在体内抑制PCSK9的作用及安全性还有待进一步研究[7]。此外，7030B-C5可以抑制PCSK9基因的转录，而四氢原小檗碱类化合物降低PCSK9的mRNA水平的作用机制尚有待深入研究[6,68]。

4.3 基因水平调节手段

4.3.1 反义RNA反义RNA通过与互补的 mRNA结合，抑制mRNA的转录，翻译或促进mRNA的降解，从而抑制相应蛋白的表达。反义RNA具有特异性强和应用便捷的特点，因此其具有较好的应用前景。多个研究报道显示，靶向PCSK9的反义mRNA如ISIS 394814、BMS-844421、SPC5001和SPC4061，能够有效抑制PCSK9的表达并升高LDLR的蛋白水平，导致LDL-C水平降低[69-72]。但此类药物也存在潜在的安全性和不良反应问题。尽管SPC5001的效果明显优于SPC4061，但因其会引起药物注射部位红疹和肾小管毒性等不良反应而被终止了临床试验[71]。目前Civi-00和ALN-PCS027(临床试验编号分别为NCT04164888和NCT01437059)已经处于1期临床试验[72]。除了传统的反义RNA外，剪接转化寡聚核酸，比如hP872主要通过调节mRNA前体的不同剪切形式从而影响同一个蛋白不同剪切体的表达水平。基于不同PCSK9的剪切体对LDLR降解作用的差异，人为增加其非活性形式而抑制其活性剪切体的表达在临床前研究中也表现出了一定的疗效[73-74]。

4.3.2 小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)siRNA能够通过降低PCSK9的mRNA水平，而抑制PCSK9的蛋白表达。1～3期临床试验结果显示，给予靶向PCSK9的siRNA Inclisiran约2周后，PCSK9和LDL水平均明显降低；Inclisiran 的疗效还具有持续时间较长的特点，在注射180 d后仍表现出较好的抑制效果；Inclisiran的上市申请已于2019年底递交至美国食品药品监督管理局[9-10],如果能够获得批准，Inclisiran将会是首个且唯一的siRNA类降胆固醇药物。此外，ALN-PCS02/ALN-PCS也已经进入1期临床试验[75]。

4.3.3 CRISPR-Cas技术CRISPR-Cas技术可以从DNA水平上特异性地敲除、敲入或替换靶向序列，是改变基因表达和活性的强有力的工具。研究证实，以腺病毒为载体的靶向肝脏PCSK9 DNA外显子的CRISPR-Cas9可以显著降低小鼠血液中PCSK9的表达，升高LDLR，降低血液中LDL水平[76]。

4.4 天然产物多种天然产物具有抑制PCSK9和降低血脂的功能，且具有较好的安全性。表没食子儿茶素没食子酸酯、紫铆花素和芦荟大黄素能够抑制SREBP-2、HNF1α或FOXO3介导的PCSK9的表达，导致LDLR升高和LDL降低[77-81]。黄连素及其同系物均能够抑制PCSK9 mRNA的转录，但似乎不影响PCSK9与LDLR的结合作用[82]。而Pseurotin A不但能够抑制PSCK9的表达和分泌，还能够结合PCSK9ASP374，从而使其不能与LDLRHis306结合[49]。丹参酮ⅡA、姜黄素、异槲皮苷和白藜芦醇等天然产物也被发现能够调节PCSK9的表达和分泌[83-85]。但目前大多数有关天然产物对PCSK9作用的确切机制还有待深入研究。

5 总结

综上所述，PCSK9是目前公认的治疗AS的有效靶点。尽管现在已经有多种形式的抑制剂，比如单克隆抗体、疫苗和小分子化合物通过降低PCSK9的表达或活性而发挥降低血脂的作用，并进入临床试验或临床应用，但目前已经上市的靶向PCSK9的抑制剂仅有单克隆抗体，昂贵的价格和非口服的给药方式严重制约着其进一步的广泛应用；此外，潜在的耐药性也会降低其临床治疗效果。因此，继续研制价格低廉、易于口服、毒副作用小、半衰期长的PCSK9抑制剂，具有非常重要的临床应用价值。此外，从天然产物中寻找特异性干扰PCSK9的表达或功能的化合物或开发特异性PCSK9的基因药物和疫苗，也均有广阔的潜在应用前景。之前因为对PCSK9的结构和功能了解有限，所以研发直接靶向干扰PCSK9与LDLR相互作用的小分子抑制剂的难度较大。目前，越来越多的靶向PCSK9的位点被报道，为小分子抑制剂的研发提供了更多的潜在位点。但关于PCSK9的结构和活性调节及其与LDLR的作用机制仍有待进一步研究，这将为靶向PCSK9抑制剂的研发提供新的靶点和思路。