星点设计-响应面法优选美洲大蠊抗肝纤维化颗粒的成型工艺*

谢静静，杨永寿，郝芳芳，肖培云

(1.大理大学药学与化学学院，大理 671000；2.浙江省温州市第七人民医院药剂科，温州 325100)

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)俗称蟑螂，其药用最早记载于《神农本草经》中[1]，近年来，美洲大蠊的药用价值受到越来越多关注。研究表明，美洲大蠊具有广泛的药理活性，包括促进组织修复、抗氧化、抗纤维化等作用[2-6]，美洲大蠊中含有多肽、黏糖氨酸、多元醇等[7]。课题组前期通过体内外试验筛选得到美洲大蠊抗肝纤维化活性部位(命名为PA-B)，研究表明美洲大蠊提取物灌胃给药对实验性肝纤维化大鼠具有较好的治疗作用[8-9]。因此，考虑以制剂工艺简单、便于包装、口服方便的颗粒剂作为制剂进行研究。由于该提取物成分复杂，其中的黏糖氨酸类物质易吸湿结块，不利于药物的保存，影响药物的稳定性。近年来，响应面法多应用于制剂工艺的优化[10-11]，因此本研究利用单因素实验对常用抗湿性辅料进行初步筛选，再利用星点设计-响应面法优化美洲大蠊抗肝纤维化活性部位颗粒的成型工艺，以改善药物的吸湿性，获得具有一定抗湿性能的颗粒，增强美洲大蠊活性部位的稳定性，为后续制剂的进一步研究开发提供依据。

1 材料

1.1仪器 TEMI880综合药品稳定性试验箱(上海蓝豹试验设备有限公司)；DHG-9420A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；AL204-IC分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，感量：0.1 mg)；GB/6003.1-2012药筛(绍兴市上虞圣超仪器设备有限公司)。

1.2试剂及药材 美洲大蠊药材由云南京新生物科技有限公司大理巍山养殖场提供(批号：M190801)，经大理大学云南省昆虫生物医药研发重点实验室杨自忠鉴定为：昆虫纲蜚蠊科昆虫美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)；美洲大蠊抗肝纤维化活性部位冻干粉(课题组自制，采用课题组前期提取纯化工艺进行制备[12-13]，每克冻干粉相当于生药137 g，批号：20180824，20180911，20180918)；乳糖(批号：180924)、微晶纤维素(microcrystalline cellulose，MCC，批号：190114)、玉米淀粉(批号：190223)、糊精(批号：190108)均购自陕西盘龙医药股份有限公司(药用级别)；乙醇(天津市福晨化学仪器厂，批号：20160712)；其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。

2 方法与结果

2.1颗粒成型工艺单因素考察

2.1.1辅料初步筛选 乳糖、微晶纤维素、玉米淀粉、糊精4种辅料，以吸湿百分率为指标进行考察，初步筛选适宜辅料，方法参照《中华人民共和国药典》2020版四部通则9103药物引湿性指导原则测定，结果见表1，由表1可知，120 h各辅料吸湿平衡后，乳糖与微晶纤维素吸湿性较低，糊精吸湿性最强。微晶纤维素是常用的成球促进剂，具有较好的成型性，在中成药制剂选用较多，而乳糖价格较高，实用性差，且增加使用成本。考虑生产成本及吸湿性，初步选用淀粉及微晶纤维素进行后续实验研究。

将药物与初步筛选的辅料按1：1混匀，加适量70%乙醇为润湿剂，20目(孔径为0.85 mm)筛制粒，烘箱干燥，以成型率为评价指标考察单一辅料及混合后与药物配伍情况。研究发现微晶纤维素颗粒成粉性较强，单独与药物配伍使用时颗粒平均成型率43.84%；而单独使用淀粉时平均成型率79.21%，但制得的软材过筛时黏筛情况严重，过筛困难导致物料浪费严重。因此最终确定辅料混合使用，可改善黏筛情况且成型率较好。

颗粒成型率(%)=成型颗粒质量/总颗粒质量。

2.1.2药辅比例考察 先将淀粉和MCC按1：1混匀，得混合辅料，再将药物与混合辅料按1：1，1：2，1：3，1：4混匀，测定吸湿率及成型率，两者综合评分为评价指标，得出最终选用药辅比例，吸湿率与成型率评分系数分别为60%和40%，见公式(1)。测定结果见表2，当药辅比为1：1时，由于药物比例较大，成团性较强，黏筛导致物料浪费严重，故综合评分未列入比较。考虑适当增加辅料的比例，当药辅比例为1：3时综合评分最高，暂定药辅比1：3进行后续实验，后续通过响应面分析优化得到最优药辅比例。

公式(1)

2.1.3辅料比例考察 在药辅比例为1：3条件下，将药物与不同比例的MCC与淀粉(MCC：淀粉分别为3：1，2：1，1：1，1：2，1：3)，以吸湿率及成型率为评价指标得出最终选用的药辅比例，由考察结果见表3可知，综合评分无显著性差异，但淀粉比例升高，制粒时软材粘性较大，而冻干粉本身具有一定粘性，二者混合后黏筛较严重，因此最终选用比例1：1进行后续实验优化。

2.1.4润湿剂浓度考察 在药辅比例及辅料比例考察的基础上，按表4加入适量乙醇为润湿剂，湿颗粒于60 ℃干燥4 h后整粒，以综合评分为考察指标筛选最优润湿剂浓度。由表4可知，乙醇浓度在60%～90%范围内，综合评分无显著差异，但70%与80%浓度时评分较高，醇的浓度升高，制软材时不易诱发药物本身的粘性而粘连在一起，同时醇的浓度会影响成型率。因此选用60%～90%浓度范围进行响应面设计优化，优选最佳乙醇浓度。

表1 辅料吸湿率考察结果

表2 药辅比例考察结果

表3 辅料比例考察结果

表4 润湿剂浓度考察结果

2.2响应面法优化颗粒成型工艺

2.2.1试验设计 以辅料-冻干粉用量比例(A)、MCC-淀粉用量比例(B)、润湿剂浓度(C)为影响因素，颗粒吸湿率及成型率的总评“归一值”为评价指标，采用中心组合(CCD)三因素五水平设计(+1、-α、0、+α、-1)进行实验，因素水平表见表5。数据采用Hassan法转化为对应的归一值，吸湿率采用公式d1，成型率采用公式d2计算，总评OD=(d1×d2)0.5，测定结果见表6。

表5 因素水平表

2.2.2模型拟合 应用 Design Expert 8.0.6版软件分析，多元线性回归、二项式和三项式拟合，并以相关系数(r)和置信度(P)为模型判定标准，选择有较大r值和较优P值对方程进行优化。多元线性回归的复相关系数较低，三项式拟合方程失拟项显著(P=0.009 3)，表示模型拟合度不高，存在失拟情况，所以不宜用线性和三次项模型。而多元二项式回归各拟合方程复相关系数均较高，表明具体实验因素对效应值的影响不是简单的线性关系，最后选择多元二项式拟合模型为成功模型。

二项式方程：Y=0.601 62-0.190 20A+0.058 319B+0.095 048C-0.072 250AB-0.0341 00AC-0.080 775BC-0.085 614A2-0.051 001B2-0.123 37C2(r=0.928 9，P=0.000 1)。

二项式方差分析结果见表7，模型中A、C、A2、C2极显著(P<0.01)，B、AB、BC显著(P<0.05)，其他不显著。各因素对成型工艺的影响程度依次为A>C>B，相关系数r为0.928 9，二次项模型P<0.05，失拟项P>0.05，拟合性较好，结果具有统计学意义。

2.2.3响应面分析 通过响应面分析，考察因素对于响应值的残差正态分布散点成较好的直线分布，残差服从正态分布，说明对随机误差具有较好的拟合。残差与方程预测值对应散点分布分析，残差与方程预测值对应散点分布分散，无规律，说明残差在-4～4之间可以解释大部分预测值，证明回归方程是有效的。图1，2，3分别为不同的响应因素对于响应值的3D响应面图。实验因素所构成的三维空间曲面图反映两变量间交互作用的显著程度，其中3D响应面的曲线陡峭程度反映了该因素下对响应值的影响大小。对于响应值总评归一值来说，药辅比(A)较辅料比(B)和乙醇浓度(C)的曲面陡峭，说明药辅比对响应值影响最大。辅料比(B)乙醇浓度(C)交互作用时，等高线排列趋于椭圆形，对响应值影响较大，乙醇浓度等高线密集，比较辅料比例对响应值影响较大，因此，综合各因素对成型工艺响应值的影响程度依次为药辅比(A)>乙醇浓度(C)>辅料比(B)。

表6 实验设计与结果

表7 二项式方差分析结果

图1 辅料比例与药辅比例对响应值的影响

图2 药辅比例与乙醇浓度对响应值的影响

2.2.4验证实验 软件拟合最佳工艺条件为辅料-冻干粉质量比2.84：1，MCC-淀粉质量比1.37：1，乙醇体积分数77.4%，预测总评“归一值”0.676 6。按最优条件制备3批抗湿性颗粒，批号为：20190302，20190313，20190324，测得的成型率为60.48%，吸湿率为5.84%，总评归一值为0.683 5，偏差为1.02%，表明该模型具备较高的准确性和精密性。

2.3颗粒物理性能考察

2.3.1流动性考察 取颗粒适量，测定休止角，休止角<40°表明制得的颗粒流动性符合要求。休止角测定仪测定颗粒休止角，使漏斗最下端与坐标纸保持1 cm高度，沿着漏斗壁倒入适量药粉，根据坐标纸上形成圆锥体的半径r，计算休止角。一般认为休止角小于30°时，流动性好，小于40°时可以满足生产对流动性的需求[10]。由表8可知，制备的3批颗粒休止角26.09°，流动性符合要求。

2.3.2堆密度测定 分别取适量颗粒，置10 mL量筒中，轻敲量筒壁直至体积不再改变，读出颗粒的体积，共测定3次，计算堆密度，即颗粒质量与体积之比[14]。堆密度反应物料粉体学性质，可为后续颗粒的保存及装填胶囊提供参考。测得3批颗粒堆密度均值为0.267 2 g·mL-1，结果见表9。

图3 辅料比例与乙醇浓度对响应值的影响

表8 休止角考察结果

表9 堆密度考察结果

2.3.3颗粒水分测定 参照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0104颗粒剂项下规定测定水分，根据减失的重量，计算供试品中含水量(%)，水分含量应小于8.0%。由表10可知，测定3批颗粒含水量为5.79%，符合相关规定。

表10 水分测定结果

3 讨论

中药制剂的吸湿问题直接影响中药的后续开发，中药吸湿后含水量较高，易发生霉变，不仅影响药物的成型，而且影响药物的稳定。美洲大蠊抗肝纤维化活性部位冻干粉具有较强的粘性和吸湿性[15]，无法保持良好的粉体性质。本研究通过加入抗湿性的辅料，辅料与药物混匀结合形成致密的防水屏障，可改善药物易吸湿的特性，以保证制剂的顺利研制。本实验初步对乳糖、MCC、玉米淀粉、糊精的吸湿性进行了考察，筛选出适宜辅料，再将药物与筛选得到的微晶纤维素及淀粉单独配伍及混合辅料配伍，可知混合辅料与药物配伍时，过筛情况及成型率较好。响应面法相较于正交设计优化工艺，可对结果进行连续的预测分析，而后者仅对单一组合进行筛选，响应面分析是当前对结果进行模型预测分析的热点。因此，本实验通过单因素实验结合星点设计-响应面法优化美洲大蠊抗肝纤维化活性部位的制粒工艺，工艺参数中药辅质量比、辅料比例及乙醇质量分数影响所制软材手捏成团轻压即散的性状，最终直接影响颗粒的成型率及吸湿率，将二者数值的归一值作为最终响应指标进行拟合优化，得到最佳条件为辅料：冻干粉质量比2.84：1，MCC：淀粉质量比1.37：1，乙醇体积分数77.4%，各因素对响应值的影响大小为药辅质量比(A)>乙醇体积分数(C)>辅料质量比(B)，通过响应面优化辅料与药物配比工艺，可改善药物吸湿易成团的性质。对优化所得的工艺进行了验证，并对所得颗粒的物理性能考察，测得3批颗粒物理性能指标休止角为26.09°，堆密度为0.267 2 g·mL-1，水分含量5.79%，结果显示颗粒流动性较好，含水量符合规定，明显改善美洲大蠊活性部位易成团结块的性质。同时对颗粒堆密度进行测定，可为后续颗粒装填于胶囊，或与适宜辅料混匀压片提供依据。