环状RNA 在DNA 损伤修复中作用的研究进展

李俊实 杨彦勇 李百龙

海军军医大学海军医学系舰船辐射医学防护教研室, 上海 200433

DNA 作为细胞遗传信息的载体，暴露于电离辐射或有毒化学物质中可造成严重的结构和功能损伤[1]。尽管细胞具有多种修复DNA 损伤的途径，但DNA 损伤（尤其是DNA 双链断裂）通常难以得到完全、有效的修复，从而导致一系列不良反应，包括细胞代谢紊乱、增殖失控、凋亡受阻、癌变以及治疗耐受等。环状RNA（circular RNA，CircRNA）是一类经反向剪接形成的环状非编码RNA，具有序列保守、不易降解和细胞组织特异性等特点。随着CircRNA 分子生物学效应研究的进一步深入，CircRNA 自身稳定的化学性质使其在细胞内无需较高丰度就能发挥与其他非编码RNA 同等水平的调控效应，故其在细胞周期调控、DNA 损伤修复等重要领域的作用逐渐引起研究者的关注。

1 CircRNA 概述

自1976 年人类首次观察到CircRNA 以来[2]，研究者陆续发现CircRNA 在不同种类的细胞中均大量存在。大部分CircRNA 由已知的蛋白编码基因产生，且广泛存在于细胞质中[3]。CircRNA 包括外显子CircRNA、内含子CircRNA、外显子-内含子CircRNA 和基因间CircRNA[4]。CircRNA 为共价闭环结构，既没有成熟mRNA 特有的5′端7-甲基鸟苷三磷酸（m7GTP）帽和3′-端多聚腺苷酸（polyA）尾结构，也不包含自由的3′5′-OH 末端，由此可见，CircRNA 是通过初级转录本中的下游外显子以反向顺序剪接到上游外显子（又名反向剪接）这一非传统方式合成的。有研究结果表明，当mRNA 前体因多个剪接因子缺乏导致CircRNA 的合成加工进程放缓时，在其反向剪接的途径中，通过上下游的Alu 重复序列、RNA 结合蛋白FUS（肉瘤融合蛋白）和QKI（Quaking 蛋白）等形成同源二聚体，拉近线性前体转录本上的供体和受体位点，继而为后续的反向剪接创造条件。此外，当外显子跳跃并形成套索样结构时，含有外显子的套索结构可以通过反向剪接形成外显子CircRNA，而由内含子构成的套索结构最后形成内含子CircRNA[5]。

相较于外显子CircRNA，外显子-内含子CircRNA和内含子CircRNA 均位于细胞核内，并能通过与U1 小核糖核蛋白（snRNP）相互作用或正向调控RNA聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）来促进自身亲本基因的转录，前者的典型代表有circEIF3J（真核翻译起始因子3J 亚基）和circPAIP2（聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白2）[5]，后者的代表则包括ci-ankrd52（锚蛋白重复结构域52）和ci-sirt7（NAD 依赖性脱乙酰酶7）[6]。随着研究的深入，研究者在细胞外囊泡中也发现了以小脑变性相关蛋白1 反义RNA（cerebellar degenerationrelated protein 1 antisense RNA，CDR1-AS）、circ-HIPK3（同源结构域相互作用蛋白激酶3）为代表的一系列CircRNA 分子的富集，推测这可能与细胞间的信息交流有关，即CircRNA 可能通过囊泡出胞的方式作用于靶细胞，发挥特定的调控作用[7]。与线性RNA 不同，CircRNA 更稳定，这是因为相较于线性RNA，其末端未暴露，不易被核酸外切酶或核糖核酸酶R 降解[5]。有研究结果表明，N6-甲基腺苷修饰的CircRNA可经由YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白（YTHDF2）和热反应蛋白12（HRSP12）依赖途径降解，其自身可能存在的特异性降解和修饰位点也引起了研究者的关注。除上述优势外，研究者还发现，在多种耐药肿瘤细胞系中，CircRNA的异常表达还与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性有关[8-9]。这些研究结果均表明，在由DNA 损伤修复失调所导致的细胞癌变中，CircRNA 可能作为一个潜在的关键分子参与介导细胞周期和信号转导通路的异常激活。

2 CircRNA 在DNA 损伤修复中的作用

如今，越来越多的研究结果表明，在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌和骨肉瘤等多种恶性肿瘤中，CircRNA 的异常变化与肿瘤细胞对放化疗的耐受性密切相关。现阶段，绝大多数研究者都着眼于CircRNA 分子经由微小RNA 这一媒介，在多个信号转导通路中靶向调控特定分子，并通过增强DNA 损伤修复、减少胞内药物聚集、目的基因扩增和构筑肿瘤微环境等方式影响肿瘤的治疗效果和预后。然而，随着CircRNA 研究的拓展，新的修复机制得以阐述并逐渐成为学术界关注的焦点。我们将分别对CircRNA 参与调控的信号转导通路和靶点进行介绍。

2.1 CircRNA 与微小RNA 的相互作用

2.1.1 表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）/磷酸肌醇-3-激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）信号转导通路

EGFR/PI3K 通路与肿瘤预后不良密切相关[10-11]。有研究结果显示，在肺腺癌中，CDR1-AS 的高表达与EGFR/ PI3K 通路中的EGFR、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α（PIK3CA）的表达水平上调呈正相关。进而促进肿瘤细胞对培美曲塞（PTX）和顺铂（CDDP）等化疗药物产生耐药性[12]。在食管癌中，CircVRK1 的含量与患者的预后呈正相关，其可能是通过充当微小RNA 海绵，吸附miR-624-3p降低了人第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）/ PI3K 介导的蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的活性，并抑制食管癌的上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），进而达到食管癌放疗增敏的效果[13]。此外，另一个CircRNA 分子circAKT3，在细胞中也可以吸附胞质中的miR-198，逆转其对调节亚基蛋白p85α表达的抑制作用，并诱导PI3K/AKT 信号分子的表达[8]。有趣的是，经证实，PI3K 激酶介导的与底物相互作用的结构域磷酸化可引起DExH 盒解旋酶9（DHX9）功能减退，并诱导下游CircRNA 分子circCCDC66 的表达，后者在结肠癌中与癌细胞对奥沙利铂的耐受性密切相关[14]。EGFR/PI3K 通路是否还存在其他的作用机制还有待进一步证实[8]。

2.1.2 Wnt 信号转导通路

Wnt 信号通路的激活增加了DNA 双链断裂修复的频率，且该通路的激活依赖于Dvl2（dishevelled segment polarity protein 2）蛋白的磷酸化。既往研究结果显示，itchy E3 泛素蛋白连接酶（ITCH）基因可以破坏Dvl2 蛋白的磷酸化，从而抑制Wnt 信号通路，促进肿瘤对化疗产生耐受。由于CircITCH对miRNA 具有吸附作用，因此，蛋白质编码基因ITCH 表达水平的升高会通过阻碍Dvl2 的磷酸化来抑制Wnt 信号通路的激活[15]，从而使食管癌细胞对放疗的敏感性降低。既往研究结果显示，Wnt3可促进β-链蛋白的稳定性，后者可调节肿瘤细胞对放疗的敏感性[16]。EMT 是肿瘤获得性放疗耐受产生的关键机制之一[17]，CircRNA 分子circRNA_100367通过吸附miR-217，可逆转后者对Wnt3 表达的抑制，进而使食管癌细胞对放疗产生耐受，并且在放疗耐受的癌细胞中E-钙黏蛋白、snail 蛋白、波形蛋白等EMT 相关蛋白分子的表达水平均显著升高（P＜0.01）[18]。此外，鉴于Wnt 信号通路与口腔鳞癌的发生发展关系密切，故相关CircRNA 分子也可能与口腔鳞癌的EMT 密切相关，可能成为潜在的治疗靶点。

2.1.3 核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路

NF-κB 信号通路同样也是CircRNA 研究领域中的热点通路。结果表明，包括circ-Sirt1（沉默信息调节因子1）在内的多数CircRNA 可经NF-κB 信号通路介导炎性血管平滑肌细胞表型转换[19]。而在人造血干细胞中，抑制NF-κB 信号通路可能导致DNA 损伤修复基因表达下调，从而造成大范围的DNA 修复错误，使造血干细胞对损伤因素敏感，对造血系统放化疗后的恢复造成不良影响[20]。上述机制是否存在于肿瘤细胞（特别是肿瘤干细胞）仍有待进一步研究证实，不过该机制本身也是一个非常有意义的切入点。而细胞周期相关激酶2（NIMArelated kinase 2，NEK2）基因作为NF-κB 信号通路的一个新的激活靶点，在细胞中可激活AKT 蛋白激酶，并促进NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）的磷酸化修饰和降解，且NEK2 还能通过调节NF-κB 抑制蛋白α 磷酸化，激活p65 蛋白入核，后者与乙酰肝素酶（Heparanase）启动子结合，上调乙酰肝素酶的表达水平，继而促进骨髓瘤的产生和发展[21]。Xia 等[9]的研究结果表明，circTNPO3（转运蛋白3）通过吸附miR-1299，提高其下游NEK2 蛋白的表达水平，从而参与DNA 损伤修复的调控。综上所述，CircRNA 既可能经由NF-κB 信号通路中的典型分子介导DNA 损伤修复，也可能通过与全新靶点的相互作用共同参与DNA 损伤修复的调控。

2.2 外泌体CircRNA 调节DNA 损伤修复

外泌体因内部包含种类丰富的蛋白、脂质和核酸而被认为是细胞间信息传递的重要分子。近年来，随着研究的不断深入，有研究者提出外泌体可能以旁分泌或远距离分泌的方式使携带的CircRNA分子被靶细胞吸收，从而改变靶细胞的治疗敏感性[22]。有研究者发现，CircRNA 分子CiRS-122 在化疗耐受的结直肠癌细胞中高表达，后者通过分泌外泌体的方式将CiRS-122 运送到其他细胞，并吸附胞内的miR-122，上调M2 亚型丙酮酸激酶的水平，使靶细胞对奥沙利铂产生耐药性[23]。与CiRS-122 相反，在对顺铂耐受的卵巢癌患者的血清和组织的外泌体中，CiRS-7（与CDR1-AS 是同一分子）的含量反而降低，这可能是CiRS-7 低表达使侵袭抑制因子CiRS-7-miR-1270-SCAI 对侵袭因子的抑制作用减弱所致[24]。已有研究结果论证了泛素化和去泛素化修饰与电离辐射相关的DNA 损伤修复存在密切联系[25]，其中涉及与DNA 损伤修复相关的研究比较少。在肝癌细胞中，外泌体CircRNA 分子circ-DB 可充当miR-34a 海绵，促进去泛素化蛋白泛素特异性肽酶7（USP7）的表达，并激活下游的泛素特异性肽酶7 /Cyclin A2 信号转导通路，发挥减少DNA 损伤、促进肿瘤生长的作用[26]。综上所述，现有研究结果表明，血清所包含的外泌体CircRNA 分子因具有丰度高和化学性质稳定的优点，既可以作为一种筛查指标，也可以作为一种载体在靶向治疗中运送分子药物，具有非常广阔的应用前景。

2.3 CircRNA 经p53 调控细胞周期

与DNA 损伤所致的上百种p53 相关基因转录本异常相比，p53 诱导基因仅促进了少数CircRNA的上调。其中，环状RNA-鼠双微粒体2 （circ-murine double minute 2，circ-MDM2）因其线性宿主基因MDM2 在抑制p53 蛋白表达水平中的重要调控作用而成为研究者关注的热点。Chaudhary 等[27]发现，使用小干扰RNA（siRNA）沉默circ-MDM2 会导致包括p53基础水平上升、细胞增殖缺陷、G1期/S 期细胞周期阻滞、Rb 磷酸化水平降低等一系列现象，同时伴有数个p53 直接作用位点的高表达。但是相关基因的转录或翻译水平几乎没有影响。研究者还发现，与单独抑制circ-MDM2 相比，在靶细胞中使用siRNA 同时抑制circ-MDM2 和p53基因，反而使细胞的增殖缺陷得到了完全恢复，这表明circ-MDM2 的调控作用可能还需要p53 介导[27]。免疫组织化学实验结果显示，circ-MDM2 的缺失使肿瘤生长功能受损，与对照组相比，circ-MDM2缺失组中细胞增殖核抗原Ki67 阳性率降低约18%。然而，Lou 等[28]针对CircRNA 分子CDR1-AS 的研究结果表明，与主流微小RNA 海绵学说相反，在argonaute 2（AGO2）蛋白和Dicer（一种核糖核酸内切酶）耗竭的人脑星形胶质母细胞瘤U87 细胞中因微小RNA 成熟障碍，造成p53 及其靶基因p21 表达水平降低；但在上述细胞中伴随着CDR1-AS表达水平上调，p53、p21 的表达水平及p53 的转录活性均得以恢复。Zhang 等[29]的实验也得出了类似的结果，和CDR1-AS 一样，circ-Amotl1（angiomotin like 1）并不是通过吸附微小RNA 来发挥自身的调控作用。既然argonaute 2 蛋白和Dicer 在微小RNA的合成和成熟过程中必不可少，那么CDR1-AS 对p53 的调控很显然不经由微小RNA 发挥作用。这提示除传统的微小RNA 海绵的角色之外，CircRNA很可能还通过其他机制参与DNA 损伤修复过程[28]。

2.4 CircRNA 与DNA 损伤修复蛋白的相互作用

蛋白质是分子调控机制中最重要的下游效应分子。研究结果表明，非编码RNA 可通过与蛋白质结合的方式参与转录、翻译等重要过程的调控[30]，作为非编码RNA 中的一员，CircRNA 很可能也通过类似的方式发挥对DNA 损伤修复的调节作用。Xia 等[31]研究发现，源自AKT 基因序列的CircRNA Hsa_circ-0017250 分子所编码的蛋白能够使AKT失活，从而增强细胞对辐射的敏感性，这增加了CircRNA 与蛋白质可能发生相互作用的途径。在针对CircRNA 分子CDR1-AS 的研究中，Lou 等[28]发现CDR1-AS 可促进DNA 损伤诱导的细胞周期阻滞和凋亡，且CDR1-AS 相较于传统的CircRNA还具有不同于miRNA 海绵的分子生物学效应：虽然CDR1-AS 的过表达与p53 蛋白水平的升高呈剂量依赖性，但TP53 的mRNA 水平并没有受CDR1-AS分子水平的明显影响，进一步的实验结果证明了CDR1-AS 可促进p53 蛋白在使用阿霉素处理的细胞中累积，而且与其在细胞核紧密共定位。不同于其他CircRNA 分子，CDR1-AS 可通过直接与p53 的核心DNA 结合域紧密结合来发挥调控作用。两者的结合会破坏p53/MDM2 复合物的形成，进而通过限制p53 泛素化降解来促进蛋白的稳定性[28]。同样，Zhang 等[29]发现另一个CircRNA 分子circ-Amotl1可以直接结合AKT 和丙酮酸脱氢酶激酶（PDK），促进AKT 蛋白的激活以及AKT、pAKT、丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）和pPDK 的核转位。在该过程中，CircRNA 并未参与调控上述蛋白的表达，这也进一步说明CircRNA 可能直接结合靶蛋白的效应分子。类似的相互作用还可能存在于其他新发现的CircRNA 分子和蛋白之间，还有待进一步研究发掘。

2.5 DNA 重组修复的调节

越来越多的研究结果表明，非编码RNA 可不依赖转录本调控临近基因的转录和表达[32]，因此，是否存在非编码RNA 与基因直接相互作用的途径也成了科学界关注的焦点。Xu 等[33]研究发现，在乳腺癌活检标本细胞中，CircSMARCA5通过与其亲本基因相互作用形成r 环，可起到抑制癌细胞SMARCA5 基因表达的作用。既往研究结果表明，SMARCA5 基因在调控DNA 修复和维持基因组稳定性方面发挥重要作用[34]。在circSMARCA5 的作用下，亲本基因仅能翻译产生截断的无功能蛋白，且免疫印迹实验结果显示，人乳腺癌MCF-7 细胞（表达circSMARCA5）的DNA 损伤标志物γ-H2AX（DNA 双链断裂标志物）表达水平明显高于对照组。此外，与对照组相比，用顺铂处理MCF-7 细胞显著提高了细胞内DNA 损伤反应蛋白细胞周期检测点激酶1（Chk1）和细胞周期检测点激酶2（Chk2）的水平。在后续的实验中，研究者将ANT（一种野生型寡核苷酸，可结合circSMARCA5）或ANT-mut（ANT 突变体，无circSMARCA5 结合能力）转染到表达circSMARCA5 的细胞中，经单细胞凝胶电泳实验和γ-H2AX 抗体检测实验发现，ANT 转染的细胞的DNA 损伤修复能力明显提高[33]，这进一步验证了之前的假设，即CircRNA 通过结合亲本基因的启动子序列，抑制目的基因的蛋白质合成，进而调控DNA 损伤修复过程。CircRNA 可能会成为继顺式作用元件和反式作用因子之后的又一大类调控目的基因转录的作用分子，如果该假设成立，CircRNA 分子在癌前筛查和靶向治疗中的应用前景将更加广阔。

3 小结与展望

随着以高通量技术为代表的一系列RNA 研究技术的不断发展，越来越多的CircRNA 在调控细胞增殖、分化、癌变等方面的作用得到了详尽的阐述。与其他非编码RNA 相比，CircRNA 自身独有的化学结构以及在部分亚细胞结构中的高丰度提示其在基因表达和细胞周期调控中具有关键作用。现阶段，大多数研究仍然着眼于CircRNA 作为微小RNA 海绵的传统作用机制，但我们认为CircRNA的分子生物学特性不止于此，越来越多的研究结果也证实了CircRNA 可不经过微小RNA 介导，直接与特定的蛋白质、核酸分子相互作用，进而调控肿瘤细胞的敏感性和DNA 损伤修复。

在诸如EGFR/PI3K、Wnt 等传统信号转导通路中，CircRNA 分子大多与肿瘤耐受性相关，鉴于分子自身稳定的化学性质和低丰度特性，很难通过传统的敲除方法达到对肿瘤细胞放化疗增敏的作用。但以circSMARCA5 为代表的CircRNA 可通过直接与基因相互作用来调节DNA 损伤修复，这可能预示着CircRNA 分子在DNA 损伤修复相关领域存在有别于传统信号通路的作用机制。虽然目前有关CircRNA 在相关领域的作用还没有成熟的研究可供临床借鉴，但在涉及癌症放化疗敏感性的相关问题上，CircRNA 仍有可能作为预测治疗耐受乃至逆转耐药性的理想分子靶点。相信随着研究的不断深入，相关CircRNA 在DNA 重组修复中新的作用机制能得到详尽阐述，并为临床肿瘤治疗和电离辐射的防护提供完备指导。

利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明 李俊实负责文献的收集与整理、综述的撰写；杨彦勇负责综述的选题与写作指导；李百龙负责综述的审阅与修订。