溶血磷脂促进奥沙利铂诱发的急性周围性疼痛

该研究的重要性声明：一线细胞抑制剂奥沙利铂可引起急性周围性疼痛和慢性神经病理性疼痛。前者与慢性神经病理性疼痛有因果关系，但对其机制了解甚少。对奥沙利铂注射24 h 后，神经组织中的细胞因子、趋化因子、生长因子和约200 种脂质进行了无差别的广泛分析，揭示了LPC 18:1、LPC 16:0 和9,10-EpOME 在奥沙利铂引起的急性疼痛中的关键作用。本研究首次证明LPC 18:1 有助于激活感觉神经元中离子通道TRPV1 和TRPM8，并在体外周注射后引起机械性超敏反应。这些发现表明，LPC 介导的脂质信号传导与奥沙利铂诱导的急性周围性疼痛有关。

1.背景介绍

化疗后多发神经病变 (CIPN) 是细胞抑制药物高剂量所引发的不良反应。奥沙利铂是广泛用于结直肠癌的一线治疗药物，可引起两种不同类型的疼痛综合征，即急性周围性疼痛和慢性神经病理性疼痛。Argyriou 等开展的一项大型临床试验表明，高达89%的病人在奥沙利铂治疗后出现急性周围性疼痛，80%患有周围性疼痛的病人在奥沙利铂治疗后引发严重慢性神经性病变的风险更高。

导致CIPN 产生的潜在分子机制仍知之甚少。Anand 等发现已知的配体门控离子通道：瞬时受体电位(TRP) 通道可能会促进奥沙利铂诱发的神经性疼痛。TRP 通道可以被辣椒素 (TRPV1)、异硫氰酸烯丙酯(TRPA1) 和薄荷醇 (TRPM8)等化学物质激活。Hohmann 等研究也证明，在病理生理条件下，由细胞因子、趋化因子和促炎性神经肽以及内源性脂质介质等炎性介质引起的TRP 通道敏化和激活可能导致神经源性炎症和外周感觉神经元活性增加，并且可能诱发CIPN 出现机械性超敏反应。有趣的是，之前研究已经证明了几类信号脂质，如类二十烷酸、亚油酸代谢产物和鞘脂等可促进疼痛超敏反应。

在本研究中，本文作者假设奥沙利铂治疗后早期发生神经元可塑性和感觉神经元活性变化。而这些神经元活动的改变可能会导致奥沙利铂诱导的急性周围性疼痛引起机械性超敏反应，并有可能增加周围神经系统后来发生慢性神经性病变的几率和严重性。

2. 结果

（1）奥沙利铂诱发的急性疼痛后的机械阈值、细胞因子、趋化因子和生长因子：为了研究奥沙利铂的急性作用，本文作者在经典的痛觉模型（3 mg/kg 腹腔注射）中通过动态足底测试评估了分别用对照剂和奥沙利铂处理的雄性和雌性小鼠的机械阈值。在腹腔注射奥沙利铂和对照剂后2、4、6、24、26、48 和72 h 测定小鼠缩足反射潜伏期。与对照组小鼠相比，注射奥沙利铂24 h 后雌雄小鼠发生机械痛敏反应，可以维持至72 h。在机械痛阈值方面，不同性别小鼠间并未观察到任何差异。同样，奥沙利铂注射后24 h 和72 h 之间也无差异。使用冷板实验和丙酮实验，研究了急性奥沙利铂治疗后对于冷痛感的影响，但治疗后未检测到任何冷超敏性反应。

（2）脂质与奥沙利铂引起的急性疼痛有关：趋化因子、生长因子和细胞因子的筛选结果显示，奥沙利铂诱导的急性周围性疼痛与经典的炎性疼痛在机理上有所不同。Piomelli 等研究证实内源性脂质介质会引起疼痛超敏反应，为了可以同时检测数百种不同的脂质，接下来对注射奥沙利铂和对照剂24 h 后小鼠DRG、坐骨神经和脊髓进行了广泛无差别的LC-QTOFMS 筛选。分析表明，在注射奥沙利铂的小鼠DRG 中，游离脂肪酸增加。接下来用LC-MS/MS 检测了由多不饱和游离脂肪酸(20:4)合成的前列腺素的浓度。此外，已知这些脂质会在炎症过程中增加，并可能导致疼痛超敏反应。与细胞因子和趋化因子类似，注射奥沙利铂后前列腺素类没有增加。相反，惊奇地观察到在注射奥沙利铂的雄性小鼠DRG 中前列腺素PGE2、PGD2 和血栓烷B2b (TXB2) 显著降低。雌性小鼠在注射奥沙利铂后24 h 后，前列腺素PGE2 和PGD2 均显著降低，但TXB2 的浓度无显著变化。

本研究观察到在注射奥沙利铂24 h 后，DRG中的游离脂肪酸亚油酸(18:2)含量大大增加。因此通过LC-MS/MS 检测了雌雄小鼠注射奥沙利铂24 h 后DRG 中的氧化亚油酸代谢物(OLAMs)的浓度。发现9,10-EpOME 均显著增加，而其代谢物9,10-DiHOME 均显著降低。

由于注射奥沙利铂24 h 后脂质浓度产生差异，接下来研究了注射奥沙利铂小鼠DRG 中相关脂质氧化酶 (COX-2，LOX，CYPs) mRNA 的表达。但是，在注射奥沙利铂后未观察到脂质氧化酶表达发生差异。同样，分析了可溶性环氧化物水解酶2 (sEH) 的mRNA 表达水平，该酶可以将环氧化物降解为二醇。mRNA 表达分析显示，在注射奥沙利铂的小鼠DRG中，sEH 转录本的表达无差异。与LC-QTOFMS 检测结果一致，这些结果表明注射奥沙利铂后的小鼠DRG 中9,10-EpOME 浓度升高的原因可能是底物亚油酸的丰度和可用性增加，而不是脂质加氧酶的表达和活性增加。

（3）溶血磷脂酰胆碱和游离脂肪酸代谢产物与奥沙利铂诱导的急性疼痛有关：溶血磷脂酰胆碱 (LPCs)的亚组是在溶血磷脂家族中检测到最丰富的脂质。本文作者分析了LPC 亚组的19 种不同脂质。结果显示在注射奥沙利铂后坐骨神经和DRG中的LPC 18:1 显著增加。在脊髓中，LPC 16:0 显著增加。

此外，检测了注射奥沙利铂24 h 后DRG 中可以从复杂脂质中释放的LPC (iPLA2) 或游离脂肪酸(cPLA2) 的磷脂酶的表达水平。发现两种磷脂酶在注射奥沙利铂24 h 后在DRG 中表达均增加。该结果与LC-QTOFMS 以及LC-MS/MS 的检测结果一致，在注射奥沙利铂24 h 后，脂质家族游离脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱的水平增加，并且9,10-EpOME浓度升高。另外，9,10-EpOME 浓度的升高验证了脂质释放酶mRNA 表达水平的升高增强了亚油酸释放量和丰度增加的假设。

（4）LPC 16:0 和LPC 18:1 导致初级感觉神经元的钙瞬变：由于注射奥沙利铂后坐骨神经和DRGs 中的LPC 18:1 和脊髓中LPC 16:0 显著增加，表明9,10-EpOME 对TRPV1 有敏化作用，使用Ca2+成像来分析LPC 16:0 和LPC 18:1 在感觉神经元中的作用。用LPC 16:0 和LPC 18:1 短时 (45 s) 刺激感觉神经元，与对照组相比，可以观察到所有测试浓度发生钙瞬变图。只有10 μM 的LPC 16:0 刺激能够显著增加响应的感觉神经元的数量。重复使用LPC 18:1 进行实验，检测到大约6%的感觉神经元在5 μM LPC 18:1 刺激后产生响应。即使用1 μM和10 μM LPC 18:1 刺激后，感觉神经元也显示出反应。但在这些测试浓度下与对照组相比无差异。以上结果显示，LPC 16:0 和LPC 18:1 都可能引起感觉神经元的瞬时Ca2+内流。

接下来，本文作者开始确定对LPC 18:1 产生反应的感觉神经元亚群。用5 μM LPC 18:1 短时间 (45 s) 刺激神经元后，用TRPA1 激动剂AITC（异硫氰酸烯丙酯，100 μM; 40 s）和TRPV1 激动剂辣椒素 (100 nM; 20 s) 共同刺激神经元。如先前所示，在5 μM LPC 18:1 刺激后，对50 mM KCl 产生反应的所有神经元中，约7%出现瞬时Ca2+内流。另外，共同刺激结果显示在LPC 18:1 上发生反应的神经元也对选择性TRPV1 激动剂辣椒素产生明显反应。接下来用30 μM LPC 18:1 刺激转染TRP 通道的HEK293 细胞60 s，与对照组相比，可以观察到TRPV1 和TRPM8 阳性转染的HEK293 细胞中瞬时Ca2+内流显著升高。在TRPA1 通道阳性转染的HEK293 细胞中，与对照组和LPC 18:1 相比，Ca2+内流未发生显著变化。相反，与LPC 18:1 相比，对照组引起显著的Ca2+内流。TRP 通道阳性转染的HEK293 细胞由特异性TRP 通道激动剂反应检测。用TRP 通道转染的HEK293 细胞进行体外Ca2+成像分析证实了先前在原代感觉神经元中的检测结果，LPC 18:1 可以作为TRPV1 通道激活剂。另外，可以将TRPM8 通道作为可以由LPC 18:1 激活的第二个TRP 通道。

（5）LPC 18:1 在感觉神经元中引起TRPV1 和TRPM8 依赖性钙瞬变：为了进一步确定LPC18:1的作用，本文作者将感觉神经元与TRPA1 (HC 030031) 和TRPV1 (AMG 9810) 以及TRPM8 (AMTB盐酸盐) 的选择性抑制剂一起孵育。研究发现用TRPA1 抑制剂孵育感觉神经元时，用LPC 18:1 对Ca2+内流没有影响。但孵育TRPV1 和TRPM8 的抑制剂后由LPC 介导的Ca2+内流显著减少。以上结果显示LPC 18:1 在通过激活TRPV1-和TRPM8 阳性神经元的伤害性传递中起着重要作用。

为了验证LPC 18:1 是否可以有效激活TRPV1和TRPM8 通道，接下来，分别用特异性抑制剂分别抑制TRPV1 和TRPM8。首先用LPC 18:1 刺激感觉神经元。然后，再次刺激前使用TRPV1 和TRPM8 抑制剂孵育神经元。抑制TRPV1 或TRPM8可以部分阻断由LPC 18:1 引起的Ca2+内流。使用TRPV1 和 TRPM8 抑制剂后，可以响应LPC 18:1 的神经元数量降低约50%。这再次表明，LPC 18:1 可能会激活表达TRPV1 和TRPM8 神经元亚群。为了检测TRPV1 和TRPM8 是否受LPC 18:1 影响，接下来使用了两种抑制剂的组合。抑制TRPV1 和TRPM8 后，由LPC 18:1 介导的Ca2+内流可以被完全阻断。此外，检测了TRPV1 和TRPM8 缺陷型小鼠中LPC 诱导的钙反应。在TRPV1 缺陷型小鼠中，观察到对LPC 18:1反应的神经元数量显著减少。在TRPM8 缺陷型小鼠中，发现了对LPC 18:1 反应的神经元数量也有减少的趋势。

（6）LPC 18:1 在体内引起机械性超敏反应：为了探究LPC 18:1 在体内是否有效，在野生型小鼠的左后足皮下分别注射了10 μM 和50 μM 的LPC 18:1和对照剂，并检测了注射后0.5、1、2、3、4 和6 h小鼠的缩足反射潜伏期。检测机械阈值后发现小鼠注射LPC 18:1 后0.5 h 出现机械超敏反应，并可以持续2 h。

3. 讨论

本研究观察到注射奥沙利铂后神经组织中各种脂质的合成发生了显著变化。LC-MS/MS 检测结果显示DRG 中前列腺素浓度显著降低，而9,10-EpOME浓度升高。后者已被Sisignano 等证明可以引发感觉神经元的TRPV1 通道敏化并在体内引起机械和热超敏反应。此外，非靶向性脂质组学分析显示在注射奥沙利铂小鼠的DRGs 和坐骨神经中，溶血磷脂酰胆碱信号增强，特别是LPC 18:1。通过对LPC 18:1 的研究，观察到在TRPV1 和TRPM8 阳性感觉神经元中，脂质可以引起Ca2+的瞬变。

在本研究中未观察到脊髓背角趋化因子、生长因子和细胞因子水平以及星形胶质细胞活化程度的变化，这表明经典的炎症过程和相关介质似乎对奥沙利铂诱导的急性疼痛影响不大。用qPCR 分析检测到注射奥沙利铂的小鼠DRG 中ROS 产生酶的mRNA 表达未发生显著增加。Doyle 等研究中发现星形胶质细胞激活以及促炎性细胞因子和ROS 水平升高可能会促进CINP。但主要研究了CIPN 的后续时间点（注射后的几天或几周）。本研究结果表明，经典炎症通路和相关介质在奥沙利铂诱发的疼痛中的作用不像在其他慢性疼痛中那么重要，因此可能是在奥沙利铂诱发神经性病变后期开始的继发性反应。此外，尽管可以观察到雌雄小鼠之间脂质浓度的差异，但奥沙利铂诱发的机械性超敏反应的程度在雌雄小鼠中相似，表明这些浓度差异对不同性别的奥沙利铂诱发的机械性超敏反应没有直接影响。

非靶向性脂质组学检测显示注射奥沙利铂后的小鼠坐骨神经和DRG 中的LPC 18:1 以及脊髓中的LPC 16:0 显著升高。据Abeele 等的研究报道，不同的LPC 种类可以调节转染后的HEK-293 细胞中TRPM8 通道的开放概率。Andersson 等在TRPM8转染的CHO 细胞中用LPC 16:0 处理后观察到相同的效果。本研究的结果与这两项研究一致，但在此基础增加了重要的实验结果，即LPC 18:1 和LPC 16:0对DRG 神经元的TRPM8 和TRPV1 通道均起作用。而Nieto-Posadas 和Canul-Sánchez 等与本研究实验结果相反，通过内面向外式膜片钳和单通道电流无法检测到由LPC 引起的HEK-293 细胞中的TRPV1激活，这表明在异源表达系统中观察到的钙瞬变是由LPC 18:1 间接激活TRPV1 引起的。

在体数据显示LPC 18:1 可引起机械性超敏反应。因此，坐骨神经和DRGs 中LPC 18:1 水平升高可能直接导致奥沙利铂诱导的急性周围性疼痛。并且发现在注射奥沙利铂24 h 后的小鼠DRG 中亚油酸衍生的代谢物9,10-EpOME 显著增加。Sisignano等的研究表明，由CYP2J6 合成的9,10-EpOME 不仅对TRPV1 通道具有直接的致敏作用，而且还可以在体内引起机械性超敏反应和热痛。实验结果显示LPC 和游离脂肪酸水平显著增加，同样本文作者也证明了cPLA2-和iPLA2-途径在奥沙利铂治疗动物的DRGs 中可能被激活。Dennis 等证明磷脂酶可以从膜磷脂中释放游离脂肪酸 (cPLA2) 和溶血磷脂 (iPLA2)。一项针对于iPLA2 途径的研究显示，由冷和TRPM8 激动剂icilin 激活的TRPM8 可被选择性iPLA2 抑制剂溴烯醇内酯 (BEL) 所阻断。而用BEL处理的在体动物实验证明由LPC 16:0 引起的冷痛敏不能被iPLA2 的抑制剂所阻断。并且iPLA2 参与了前列腺素的生产过程，通过BEL 抑制iPLA2可以导致前列腺素浓度降低。本研究表明了靶向iPLA2 途径并通过抑制CYP2J6 减少9,10-EpOME合成可减轻奥沙利铂诱导的急性疼痛。但目前尚没有可以用作临床候选药物的选择性iPLA2 拮抗剂，需要进行更多研究来探索iPLA2 的潜在生理作用，这可能给治疗的病人带来不良反应。

除脂质信号传导途径外，本研究结果表明靶向TRP 通道可能有利于阻断奥沙利铂诱导的急性周围性疼痛。Chukyo 等研究表明，在奥沙利铂治疗后，DRG 中TRPM8 和TRPV1 转录本在后续时间点增加，并可能导致冷痛敏。此外，Wong＆Gavva 等报道称辣椒碱通过抑制TRPV1-和TRPM8 通道降低奥沙利铂诱导的体内冷性异常性疼痛，而不仅仅是5´-碘树脂毒素抑制TRPV1-通道。但目前尚无可用于临床的TRP 通道拮抗剂。先前的TRPV1 拮抗剂早期临床试验由于导致病人体温过高而失败，这表明TRPV1 在维持体温方面起着重要作用，并阻碍了安全的TRPV1 拮抗剂的临床开发。

综上所述，本研究突出了奥沙利铂治疗后神经元脂质合成和代谢早期变化的重要性，并确定了LPC-EpOME-TRPV1-TRPM8 信号通路脂质在奥沙利铂诱导的急性疼痛中的关键作用。