输入蛋白α3 在外周感觉神经元调节慢性疼痛

输入蛋白α (Importin α) 是真核细胞进行核转运过程中起关键作用的核转运蛋白的一个亚家族，参与大细胞（如神经元）的胞质转运过程。尽管不同输入蛋白之间的特异性存在重叠，但由于表达谱的差异和对被载蛋白亲和力的不同，使得单个输入蛋白能调节特殊的功能。本文作者试图通过对Importin α3 敲除鼠的行为学研究来探索神经元中输入蛋白的功能。结果发现，Importin α3 敲除鼠特异地表现为对伤害性热刺激的反应减弱，并在注射辣椒素后没有表现出明显的痛反应。

本文作者通过鞘内注射腺相关病毒9 (AAV9) 急性敲减或过表达Importin α3 等方法来确认以上实验结果，与给予对照shRNA 的小鼠相比，Importin α3 敲减鼠表现为对伤害性热反应的缩足潜伏期延长，而对探索行为和运动协调功能没有任何显著的影响。通过对敲除鼠进行Importin α3 过表达后的表型反转实验证实了以上表型的特异性。相反，在敲除鼠中进行shRNA 敲减后不能进一步地延长缩足潜伏期。因此，Importin α3 的特异性缺失会减弱实验动物对各种伤害性刺激的反应。

接下来，本文作者用坐骨神经分支选择损伤模型 (SNI) 来评估Importin α3 在神经病理性疼痛中的作用。在SNI 后的3 个多月内定期检测野生型 (WT) 小鼠和基因敲除小鼠对机械刺激的敏感性。结果发现，WT 鼠和Importin α3 敲除鼠的早期反应相似，但从第60 天（晚期）开始有所不同：Importin α3缺失的小鼠表现出对SNI 的耐受性增加、对触觉的敏化性降低、并减少了无刺激状态下的足爪蜷缩现象，而WT 小鼠没有表现出任何的改善。在SNI 造模之前，敲减Importin α3 也得到了类似的结果：从SNI 造模后60 天开始，给予对照shRNA 的模型鼠在CatWalk 步态分析中表现出典型的爪印宽度减少的自发足爪蜷缩表型，而给予Importin α3 shRNA的模型鼠表现出步态参数的改善和足爪蜷缩表型的减轻。机械敏感性实验表明，对照shRNA 鼠和Importin α3 shRNA 鼠的神经病理性疼痛反应在损伤后60 天内的表型相似；而从第60 天起，与对照shRNA 鼠相比，Importin α3 敲减鼠的缩足反射明显改善。因此，Importin α3 的敲除和急性敲减都显著缓解了SNI 诱导的慢性神经病理性疼痛。

由于多种不同类型的细胞参与神经病理性疼痛，Importin α3 对神经病理性疼痛的作用是否特异地发生在感觉神经元呢？本文作者首先验证了鞘内注射AAV-PHP.S（一种外周神经元特异性衣壳亚型）可特异性并有效地感染背根神经节 (DRG) 神经元。之后在SNI 模型鼠鞘内注射AAV-PHP.S 载送Importin α3 shRNA，行为学检测发现，SNI 模型建立后在感觉神经元内敲减Importin α3 也能减轻神经病理性疼痛。

为了进一步研究Importin α3 敲除减轻SNI 诱导的神经病理性疼痛的分子机制，本文作者比较了SNI 后1 周和11 周（疼痛明显缓解时）的DRG 转录组，筛选出一些因Importin α3 缺失而受到影响的转录因子。在这些因子中，由于c-Fos 是一个公认的疼痛通路激活标志物，因此激活蛋白1 (AP1) 家族被优先考虑进行下一步研究。对SNI 后4 个AP1靶基因的定量分析显示，与WT 相比，Importin α3缺失的DRG 中Syngap1 和RTL1 的表达减少，而Syngap1既往被认为是参与触觉处理过程的一个分子。

c-Fos 的特点是既有Importin α 结合的核定位信号，又有转运蛋白 (transportin) 的结合基序，而转运蛋白是一种独特的核输入因子。文献报道Importin α和c-Fos 两个核输入因子家族的多个成员在感觉神经元中广泛表达。本研究也证实Importin α3 和c-Fos 在DRG 神经元中确有表达。并发现它们之间的相互作用通过在转染的Neuro2a 细胞中邻近生物素化方法和感觉神经元中的内源性蛋白邻位连接技术 (PLA) 而证实。在Importin α3 敲除的神经元中，c-Fos 的基础水平表达没有改变。在WT 鼠DRG 神经元中c-Fos 大部分在核内，而在Importin α3 缺失神经元中只有很少或几乎没有c-Fos 的核积聚现象。因此，Importin α3 是成熟感觉神经元发生c-Fos 核积聚所必需的。

c-Fos 抑制剂T-5224 是一个镇痛有效性正在研究中的药物。本文作者通过腹腔注射T-5224 对WT和Importin α3 缺失鼠的作用进行了比较，研究发现T-5224 可延长WT 鼠对伤害性热刺激的缩足潜伏期，但在Importin α3 缺失鼠中除了已经存在的疼痛减弱之外，没有更大的影响。然而，T-5224 改善了WT鼠在SNI 诱导后1 周的vonFrey 实验中的缩足潜伏期，而对这个时间点的Importin α3 敲除或敲减鼠没有影响。因此，认为干预c-Fos 具有镇痛作用，而Importin α3 可能主要在神经病理性疼痛的后期维持阶段发挥作用。

为了确认AP1 通路是晚期神经病理性疼痛所必需的，本文作者在SNI 模型鼠对c-Fos 或c-Jun 基因进行了敲减。与Importin α3缺失的效果类似，c-Fos敲减减弱了对伤害性热刺激的敏感性，而不影响基础机械刺激的敏感性；而c-Jun 敲减既减弱了对伤害性热刺激的敏感性，也减轻了对伤害性机械刺激的敏感性。进一步比较c-Fos、c-Jun 和Importin α3敲减在SNI 模型中作用，发现这三种shRNA 均在神经损伤后67～90 天时间段，显著缓解了神经病理性疼痛；此外，神经元内特异性表达a-Fos（即AP1 显性负型形式），显著降低了小鼠对伤害性热刺激敏感性，而不影响对基础机械刺激敏感性，但能显著缓解SNI 的晚期神经病理性疼痛。因此，认为抑制AP1 通路可以减轻SNI 模型诱发的神经病理性疼痛。

最后，本文作者使用Connectivity Map (CMap) 数据库进行生物信息学筛选，搜索可能作用于Importin α3-c-Fos 通路的药物。筛查了大约50 种CMap 得分较高的化合物，其中有35 种对疼痛的作用还不明确。本文作者选择了其中3 种化合物进行下一步实验，它们是阿马灵（抗心律失常的生物碱）、舒马唑（强心剂）和磺胺甲二唑（抗生素）。研究发现，阿马灵对伤害性热刺激无影响，但舒马唑和磺胺甲二唑在实验中均表现出有效性：后两种药物在SNI 的早期和晚期都表现出时间和剂量依赖性的镇痛作用，与敲除或敲减Importin α3 一样有效地改善SNI 鼠对伤害性机械刺激的反应。此外，舒马唑和磺胺甲二唑可显著减少WT 神经元中c-Fos的核积聚，但对Importin α3 缺失神经元中的c-Fos核积聚没有任何影响。以上研究结果表明，模拟Importin α3 缺失的药物可以重现在Importin α3 突变鼠中观察到的镇痛和c-Fos 核定位效应。

综上所述，在神经病理性疼痛的维持阶段，Importin α3 通过干扰感觉神经元c-Fos 的核输入过程，降低对伤害性刺激的敏感性，而特异性发挥镇痛作用。直接抑制c-Fos 功能，在神经病理性疼痛的早期和维持阶段均可有效镇痛，表明c-Fos 核输入的其他方式或其他转录因子可能控制早期的痛反应过程，而Importin α3 在晚期慢性疼痛中起关键作用。最近有研究发现在脊髓环路水平上，快速厌恶行为和持续性疼痛反应有所不同，不同类型细胞在机械敏感性和伤害感受作用也不同。本研究表明，Importin α3 对持续性神经病理性疼痛的调控作用发生在外周感觉神经元水平。以前的研究发现Importin α3 和c-Fos 在小鼠和人类DRG 中是保守的，而最近的一项研究报道了神经病理性疼痛病人DRG中AP1 家族基因显著上调，突显了Importin α3 作为镇痛靶点的潜力。由于现有镇痛药的止痛效果有限，加上明显的不良反应，慢性疼痛的临床治疗满意度不足。而最常用的阿片类药物具有耐受性和依赖性的多重风险，又可能导致不同程度的滥用。目前在疼痛领域中正在进行药物研发的大多数靶点属于离子通道和神经递质受体，它们多位于质膜和突触处。Importin α3 在分子识别和亚细胞定位水平提供了可替代的新靶点，为未来镇痛药的研发提供了新机遇。