泪液蛋白质组学分析在眼部疾病中的应用及研究进展

伍 满，谭 亭，王 平

0引言

泪液是由多种成分构成的混合物，其中任何成分的质或量的变化或可提示疾病的发生、发展，近年来越来越多的研究者聚焦于泪液标本的研究，以此来探寻相关疾病。目前研究表明，泪液由水和蛋白质、电解质、糖类、有机酸、核苷酸、甾醇、维生素、脂类、碳水化合物及其它低分子量和高分子量化合物等组成，水约占其中的98%～99%[1-2]。泪液各个成分的相对稳定维持着眼部的健康，同时泪液成分的变化也受眼部疾病的影响，如Kalló等[3]研究的糖尿病眼部并发症及甲状腺相关疾病等都可引起泪液成分的变化，泪液作为非侵袭性的检测体液的理想材料，近年来引起了广泛的关注，学者们研究了其在眼部疾病中的变化，现将应用蛋白质组学研究方法分析泪液成分变化及其与眼部疾病的关系进行综述[4]。

1泪液标本的收集与保存

泪液的收集方法对标本的影响较大，所以，采用正确的收集方法对结果的可靠性至关重要。为了尽量减少对泪液成分的影响，采集时多采用无麻醉且无刺激下收集，目前收集泪液标本的方法多为以下几种，即玻璃微毛细管收集[5-6]、Schirmer试纸收集、吸收性滤纸片及纤维素海绵、棉线[4,7]；玻璃微毛细管是从眼外直接抽吸眼液。它被认为是避免反射性泪液分泌的最佳方法[8]。但是，处理时需要足够的经验和技术，并且很耗时。因此，在实验研究或临床应用中是有局限性的，如涉及儿科人群时。此外，对于焦虑或不合作的患者，都将引起不可靠的结果；Schirmer试纸在干眼症的诊断中是一种简便而快捷的眼泪收集方法，也适用于临床常规检查[9]。纸带被放置在每只眼睛的下穹窿中，并留在原处，直到纸带被润湿到控制线为止。但是，试纸条可能会引起强烈刺激，从而导致不必要的分析物稀释；海绵是从眼外收集泪液，大多患者可以很好地耐受，此外，海绵可以标准化收集眼泪体积，将不同材料的海绵和各种提取缓冲液进行组合和测试，以优化泪液收集方法并克服最常见的局限性，但是很难比较结果，另一个主要问题是某些细胞因子与海绵紧密结合，在提取过程中造成困难，用这种方法也可能发生眼泪反射，导致不必要的稀释[10]；有研究报道另一种适用于泪液较少的患者的方法：眼泪冲洗技术(具体操作方法是将50～60μL平衡盐液冲洗眼睑至眼睑褶皱，用无菌塑料微管快速收集眼泪)[11]。此外，最新研究报道了一种与眼前表面接触的尖端[眼前接触尖端(PCT)]以使对眼表面的损害最小化的收集泪液的方法，报道称此比玻璃毛细管损伤更小[12]，但目前使用玻璃毛细管收集眼泪仍是最常用的、避免眼泪反射的最佳采样方法[13]。标本的保存对成分的影响同样重要，目前研究推荐泪液标本的保存温度包括-80℃、-70℃、-20℃以及4℃[3, 14-17]，深低温冻是泪液样品存储的首选方式[15]。

2泪液蛋白质组学

蛋白质组学是澳大利亚科学家于1994年提出的[18]，起初多被用于肿瘤标记物的测定[19]，后逐渐用于眼部疾病[20-23]，其过程主要包括蛋白质的分离、鉴定及相互作用，实现手段包括多维色谱法(如离子交换色谱法等)、多维电泳技术(如二维凝胶电泳等)、亲和法(如免疫印记法等)、细胞器、膜复合体分离、氨基和羧基末端分析、质谱法(如肽片段质谱及串联质谱)、免疫共沉淀、酵母双杂交系统、蛋白质芯片技术等，其中质谱法是应用较为前沿的一种常用技术[24]。泪液分析是一种新的诊断疾病的方法，有研究表明，应用蛋白质组学在泪液中发现了1543种蛋白质，其鉴定的错误率小于1%，这是目前报道的最多的泪液中存在的蛋白质数量，其中溶菌酶(2～4mg/mL)、乳铁蛋白(1.2～3mg/mL)和脂钙素(1～2mg/mL)是含量最高的蛋白质[25]。蛋白质在眼部起着重要生物功能，如抗炎(如溶菌酶可裂解细菌的细胞壁)、抗病毒、参与免疫反应、凝血过程、能量反应过程、氧化应激反应、变态反应、予结膜角膜等提供营养和生长因子[26]参与眼表组织损伤重塑，与泪膜中的脂质不可逆结合，参与泪膜表面张力形成、流变学和动力学等[25]。

3蛋白质组学在眼部疾病中的应用

3.1干眼眼泪中的蛋白质对维护眼表功能具有重要作用，而眼泪成分的质和量的变化都反映了眼表健康状况，据报道称干眼的发病率目前已从2%上升到50%以上[27]，影响着全球一半人的眼表健康，且仍有继续增加的趋势，现已有较多研究应用蛋白质组学的方法发现干眼患者中存在许多蛋白质的变化，如Jung等[28]研究发现干眼患者的泪液中蛋白的最大数量为1700种，比健康人群的1 500多种多出100余种，并认为干眼最重要的发病机制为泪液中异常蛋白质引起的免疫炎症反应。不同原因导致的干眼蛋白质变化不同，Perumal等[27]表示在大多干眼患者泪液中普遍存在S100-A8蛋白显著增加的现象，且富含脯氨酸的蛋白4、溶菌酶C(LYZ)及蛋白3和α-1-抗胰蛋白酶的蛋白质含量也增加，而细胞外糖蛋白、α-烯醇化酶、血清转铁蛋白、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1、α-1-酸性糖蛋白1、醛脱氢酶等蛋白质则存在降低现象；在泪液缺乏型干眼中则主要是表达免疫应答的蛋白质功能降低了，而表达炎症反应，分解代谢过程，细胞死亡，创伤反应等的蛋白质数量明显增加；Aluru等[29]发现在继发于类风湿关节炎的干眼中，80%以上的病例中都显示核糖核酸酶p蛋白亚基20、原钙黏蛋白和异核核糖核蛋白q亚型6表达下调，而二磷酸腺苷核糖基转移酶5抗体、RhoGTP酶等蛋白表达则上调，而半乳凝素3降低[30]，Nod-1蛋白的表达是增加的[31]，Aqrawi等[32]的研究也认为干眼的发生与患者泪液中DNA裂解酶、重组人过氧化物还原酶3、钙离子依赖性的磷脂结合蛋白酶1、顺乌头酸合酶、LIM域特有蛋白7等的蛋白升高有明显关系。干眼患者泪液中蛋白质的变化量庞大复杂，目前尚无一致结论，大部分蛋白质的变化与炎症及免疫反应有关[33-36]，这或可提示着干眼的病因治疗更侧重于抗炎及免疫调节。

3.2睑缘炎睑缘炎因其缺乏早期诊断依据，在临床上治疗相对困难，研究表明，睑缘炎患者的泪液成分也有改变，如Kim等研究表示运用二维电泳技术发现睑缘炎患者与健康患者泪液成分相比，血清白蛋白前体、α-1抗胰蛋白酶、催乳素、溶菌酶、催乳素诱导蛋白、胱抑素-SA Ⅲ、丙酮酸激酶及一种未命名的蛋白质的表达都至少下调了50%[37]，而Song等[38]则发现慢性睑缘炎患者泪液中分泌型Ⅱ型PLA2活性显着高于正常对照组，并表明此酶可增加磷脂的水解而降低泪膜的稳定性，睑缘炎泪液成分的变化或可给予其早期诊断提供新指标，但其泪液成分变化的研究尚少，其机制及意义有待进一步详细研究。

3.3结膜松弛对于结膜松弛的患者以泪液做标本应用蛋白质组学的研究尚少，有研究应用蛋白质印迹等技术在结膜松弛患者的泪液中鉴定出一系列蛋白质表达上调，例如S100A4，S100A8和重组人过氧化物还原酶-5等，且这些蛋白被认为是炎症和氧化过程的标志物，以此猜测其表达水平可能有助于评估疾病的严重程度和进展[39]，但结膜松弛的发病机制是否与泪液中的蛋白质变化相关，可以从机制中阻断该疾病的发生发展，这些仍是目前存在的问题。

3.4角、结膜炎角、结膜炎在临床上极其常见，严重影响患者视力，现已有大量研究表示了该疾病存在明显的泪液成分变化，Li等[40]研究表明在过敏性结膜炎患者的泪液中发现其总蛋白浓度及一些主要的泪液蛋白成分增加，如脂蛋白相关磷脂酶A2的含量升高，而Leonardi等[41]通过iTRAQ定量蛋白质组学研究发现，春季角结膜炎患者泪液标本中血清白蛋白、转铁蛋白和血红蛋白的水平比对照泪液水平高100倍，并表示其与疾病的严重程度相关，同时其血红素、转铁蛋白、乳球蛋白β和分泌球蛋白表达明显增加，而在局部使用环孢素或皮质类固醇激素治疗后其泪液样本中这些蛋白质水平则明显降低，该结果提示其中某些蛋白质的变化与该疾病有一定相关性。在热带地区，曲霉菌和镰刀菌更易感染导致霉菌性角膜炎，Parthiban等[42]认为在对曲霉菌感染的患者的泪液标本进行分析时发现，α-1抗胰蛋白酶、载脂蛋白、结合珠蛋白-α链、结合珠蛋白-β链、乳铁蛋白及白蛋白随疾病进展表达量增加，而催泪蛋白前体、胱抑素SN前体和锌α-2糖蛋白(ZAG)在晚期则表达下调，且ZAG存在于疾病整个过程，同时在镰刀菌感染患者中ZAG也出现了变化，该研究提示在疾病早期就可通过检测ZAG的水平作用检测黄曲霉菌或镰刀菌的感染，提示了解ZAG在其中的作用对角、结膜炎可能会带来新的早期诊断标准及干预措施。

3.5圆锥角膜圆锥角膜(keratoconus，KC)是一种进行性角膜变薄疾病，与重要的组织重塑和多种信号网络的激活有关，该病的病因尚不清楚，治疗困难，所以探讨其致病因素将对临床有重要意义。Yenihayat等[43]通过荧光2D凝胶电泳与MALDI-TOF/TOF联用研究发现圆锥角膜患者的泪液中的血清清蛋白、角蛋白Ⅱ型细胞骨架1、免疫球蛋白γ-1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、α-1抗胰蛋白酶和载脂蛋白A1等表达出现下调，但溶菌酶C、角蛋白I型细胞骨架10和脂蛋白的表达则出现上调现象，以此研究者推测这些蛋白将参与圆锥角膜形成重要步骤；Pannebaker等[44]应用质谱等方法研究也发现在圆锥角膜患者的泪液标本中都出现了基质金属蛋白酶-1的表达增加，且猜测与其相关的一些特征性蛋白质，其中包括几种角蛋白、免疫球蛋白α和κ、催乳素的前体，溶菌酶C和脂蛋白等，但具体与圆锥角膜的病因的相关性仍待进一步探讨。另一方面Balasubramanian等[45]应用电泳、质谱、光谱技术等方法研究KC泪液标本，发现患者的眼泪中组织蛋白酶B的水平上调了3倍,而聚合免疫球蛋白受体则约下调了9倍之多，纤维蛋白原α链下调约8倍，胱抑素S和胱抑素SN则下调约2倍，且研究者还发现角蛋白1型细胞骨架14和角蛋白2型细胞骨架5仅存在于KC患者的泪液中，而其在KC的病理生理过程中具体扮演什么角色尚不可知，但发现蛋白酶抑制剂的减少和蛋白酶的增加提示了KC的潜在分子机制，通过蛋白质机能途径分析还发现，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原态衍生物(NADHX)修复途径参与了KC过程，而NADHX是几种脱氢酶的抑制剂，影响大多正常生理过程，这或是KC形成的重要步骤，同时为KC的治疗及预防提示了新方向[46]。

3.6葡萄膜炎对于葡萄膜炎患者的泪液标本做蛋白质组学研究极少，少量报道了特发性关节炎儿童葡萄膜炎患儿以眼泪为标本行液相色谱-串联质谱等方法，发现标本中含有SEMA3G，TIMP1，HEXB，ERN1和SAA1等具有较高的与炎性关节炎相关的蛋白质的表达，但具体关联尚待继续探讨[47]。

3.7青光眼青光眼是全球不可逆性失明的主要原因之一,早期诊断仍是主要挑战。有报道以患者泪液为标本应用蛋白质组学做相关研究，结果显示原发性开角型青光眼与对照组相比，发现其中的差异蛋白，且这些蛋白与炎症反应、自由基清除、细胞间信号传导和相互作用有关，以此猜测泪液中表达的相关炎症的蛋白质可能是原发性开角型青光眼潜在的生物标志物[48],还有研究者发现，长期使用相关抗青光眼药物的患者眼泪标本，与非药物治疗组比较，S100-A8、S100-A9、乳腺珠蛋白B和14-3-3ζ/δ的泪液水平显著增加，局部药物治疗不到1a的泪液中显示富含脯氨酸的4蛋白水平降低，使用局部抗青光眼药物治疗时间超过1a可能会引起眼表的炎症反应，该结果对抗青光眼的药物治疗具有一定指导意义[49]，也为青光眼发病机制研究提供了新方向。

3.8甲状腺相关眼病甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)泪液的蛋白质谱分析主要表现为血清白蛋白和免疫球蛋白κ链C区的明显降低和补体C3几乎完全缺失以及血浆白蛋白的减少，从而降低了细胞外的抗氧化及防御，而氧化应激反应不但引起严重的组织损伤，也加速炎症的进展，补体C3是三条补体激活途径的重要组成部分，但在关于免疫球蛋白k区C链的减少，如何影响TAO的机制仍待进一步研究[50]。还有研究者经过SDS-PAGE凝胶电泳发现TAO患者泪液标本中溶菌酶C、乳铁蛋白等表达均上调，这可能分别预示着眼眶和泪腺的免疫性炎症的进程及氧化应激反应的发展。并且研究认为两者在防止细菌入侵方面具有协同作用，并猜测两者在TAO发病的免疫机制中可能存在着协同的作用[51]。

4总结与展望

随着蛋白质组学研究技术的发展，为眼部疾病的病因研究及治疗提供了新思路，可以更准确地测定泪液成分变化与疾病密切相关的特征性改变,为疾病的诊断及药物疗效的评价提供依据，我们可以以此为思路用于更多的疾病研究，探索其他眼部疾病乃至全身疾病在泪液成分中的特征性改变，泪液标本或可成为常规体液检查，这或可比现有的检查方法更方便、无创、快速，对泪液标本的探索将对眼部疾病的临床诊断和治疗带来巨大的革新。