钛表面纳米形貌及特性对成纤维细胞影响的研究进展

刘玉洁，李保胜，张震阳，欧燕珍，孟维艳

天然牙中，冠根方向上龈沟底到牙槽嵴顶之间的恒定距离为3～4 mm，即软组织的“生物学宽度”，包括近冠方约2 mm的结合上皮以及近根方的结缔组织，而在种植体周围也存在类似天然牙的生物学宽度。生物学宽度对于维持种植体周围软硬组织健康具有重要意义。为了维持生物学宽度，避免细菌渗透破坏种植体初期愈合或长期效果，早期软组织细胞粘附和长期软组织封闭屏障的维护至关重要，是组织整合的关键部分。

众多表面处理技术中，纳米技术作为当下研究热点有望对下一代医疗设备的设计、开发和制造产生重大影响。纳米结构表面对细胞行为的调控是近年来的研究热点，其中模仿天然纳米尺度的界面在生物材料研究领域引起了广泛的兴趣。由于细胞行为可以受可溶性因子、细胞间相互作用、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)相互作用的调控[1]，改善细胞及ECM作用的种植体纳米级结构可以影响细胞诸多特征，从形态到基因表达。

1 天然牙和种植体周围的结缔组织

天然牙周围牙龈组织的生物封闭不仅依赖于上皮附着，还依赖于牙龈纤维将结缔组织附着在牙根表面，尤其是龈牙纤维和Sharpey纤维。牙周膜中胶原纤维数量最多，主要有Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅻ型胶原。其中Ⅰ型胶原成分最多，由上皮细胞和成纤维细胞共同分泌形成。直径约70 nm的胶原纤维聚集成直径几微米的胶原束，以Sharpey纤维的形式垂直插入牙根表面的牙骨质。牙龈纤维的垂直附着可以提供强大的粘附力，阻止上皮根方迁移，在维持上皮附着水平和牙齿悬吊中起着重要作用，从而抵抗牙周牙龈组织炎症和机械应力。

早期研究认为种植体周围纤维走行平行于种植体表面，但是后续研究发现种植体周围的纤维可以向不同方向延伸，甚至垂直伸入种植体多孔表面[1-3]。垂直于种植体表面的纤维走行可以增加结缔组织的粘附性，抵抗结缔组织/种植体界面的机械性撕裂。通过电泳融合的方法将Ⅰ型胶原垂直插入直径约67 nm的二氧化钛纳米管中，作为结缔组织初期结合位点，可以明显抑制上皮的伸展及上皮层的形成[4]，说明了垂直了种植体表面的纤维可以阻止上皮细胞根方迁移。另外，种植体周围有许多Ⅴ型胶原纤维，对胶原酶具有抵抗性，因此种植体周围的结缔组织通常呈慢性炎症状态，而不是拦截或防御状态[5]。

结缔组织中成纤维细胞通过黏着斑粘附在种植体表面上，黏着斑蛋白表达增加与成纤维细胞粘附强度的提高相关，通过改变种植体表面微纳米形貌调节成纤维细胞的粘附性及形态，对于抵御种植体周炎具有重要意义。

2 种植体表面特性对软组织整合的影响

Albrektsson和Wennerberg将种植体表面特性分为三类：机械性能、形貌性能和理化性能。他们指出：这些特性是互相影响的，改变其中任意一个特性，其他特性也会随之改变[6]。为了促进种植体/软组织界面结合的强度和稳定性，提高短期和长期预后效果，本文重点关注表面形貌及理化性能中湿润性对结缔组织的影响。

2.1 表面形貌与粗糙度

有研究认为成纤维细胞表现在纳米级或者微米级结构的表面上无明显差异[7]。但是相比于单一的微米形貌而言，在微米级结构材料上赋予纳米级结构可以明显促进人牙龈成纤维细胞的功能，包括粘附性、增殖性以及Ⅰ型胶原的合成[8]，这表明纳米级结构的存在对成纤维细胞具有重要意义。

不同于上皮细胞的是成纤维细胞在轻微粗糙表面的表现似乎更好。光滑的钛种植体表面会被纤维包膜所包绕，使得组织几乎与种植体表面相分离，但是纳米管有良好的组织整合性，可以明显促进细胞和组织的粘附力，甚至减少炎症因子的释放[9]。研究对比钛纳米管管径方面，认为管径范围在70～90 nm有利于人牙龈成纤维细胞的粘附和增殖反应[10-11]。但是，动物体内实验认为直径100 nm的钛纳米管和机械处理的光滑表面软组织附着表现相似，纤维走行依旧平行于种植体表面[12]，在管径为40 nm的纳米管上培养人表皮成纤维细胞也未见细胞粘附性有明显提高[13]。国内学者发现100 nm管径的纳米管比20、200 nm管径纳米管更适合人牙龈成纤维细胞的粘附、增殖和Ⅰ型胶原分泌[14]。在酸蚀20 min和60 min的表面上分别形成粗糙度为0.1～0.15 μm和0.5～0.7 μm的凹坑及突起结构，成纤维细胞接种培养3 d后未见两组间有增殖、Ⅰ型胶原合成的差异[15]，不同处理方法虽然可以形成不同粗糙度的表面，但是这种差别对细胞行为似乎不具有意义。

材料表面凹槽走行可以调控细胞取向，在机械加工获得的平均粗糙度为(0.104±0.010)μm、凹槽宽度为100～200 nm的钛表面上，虽然成纤维细胞增殖活力没有改变，但是纳米凹槽走形能有效地驱动早期(48 h)牙龈成纤维细胞的取向，促进细胞的粘附性[16-17]。值得注意的是制备不同纳米形貌表面修饰可能是在钛表面上创建类似于天然牙Sharpey纤维状结构的解决方案之一。在碱热法形成的纳米孔隙直径约200 nm的表面上，Kato等见到了成纤维细胞外基质伸入到亚微米级突起、孔隙及沟槽之间，兔体内实验验证了种植体周围纤维垂直走行类似于牙周膜[4]，对人皮肤成纤维细胞的研究中，这种纳米级孔隙和突起可以促进ECM的合成，在ECM和材料表面之间建立充分的机械整合，以抵抗机械、酶和化学剥离处理，且不引起促炎反应[18]，证实了表面形貌改善种植体周围软组织封闭的可能性。

另外，植体周围的成纤维细胞会发生纤维化，其中细胞粘附性、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达以及细胞外基质沉积增加是细胞纤维化的标志，有研究发现相比于光滑钛片，喷砂酸蚀处理后的粗糙钛片表面上人牙龈成纤维细胞中α-SMA和纤连蛋白含量更低、粘附面积和粘附强度均较低，胞外基质重组相关基因上调，认为特定钛片表面形貌可以抑制人牙龈成纤维细胞向成肌纤维细胞分化，对于减少瘢痕组织的形成具有意义[19]。

虽然粗糙度似乎对细胞行为无明显影响，但是表面形貌确实会对细胞进行调控。有研究通过制备具有微米级沟槽和纳米级孔的分层微纳米复合形貌，将其与光滑表面和不规则微米尺度的表面进行比较，发现整合素在复合微纳米表面上的表达要高于另外两个表面，且证实了整合素α2-PI3K-AKT信号轴在分层微纳米形貌促进细胞粘附和成骨分化中发挥关键作用[20]。而在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，适当的表面形貌可以使H3K27快速去甲基化，使成骨相关基因启动子区域的H3K4me3水平升高[21]。这些都验证了形貌对细胞命运的重要影响，但表面形貌在成纤维细胞中的作用机制的研究仍不充足。

2.2 湿润性及表面自由能

润湿性被认为是种植体重要的表面特性。通常使用液体-固体接触角(contact angle，CA)来量化湿润性，CA是三相边界处液滴表面的切线与液体一侧水平固体表面之间的角度。通常表面水接触角小于90°被认为属于亲水性，表面水接触角大于90°被认为是疏水的。但湿润性除了与材料极性基团赋予的内在性质——亲水性、疏水性有关外，还与物体表面性状如孔隙有关，只有当固体表面完全光滑平整时，材料表面对水的湿润性才完全取决于物体内在的亲疏水性，所以平时看到的接触角更多反应的是材料对水湿润性的高低[22]。

受表面化学以及表面形貌影响的表面润湿性和相关的表面能对于优化材料周围生物活性至关重要。增加湿润性可以增强种植体表面与生物环境之间的相互作用。表面润湿性不仅影响蛋白质的吸附，对细胞的粘附和迁移也有重要作用，在设计植入物时，表面能具有选择性抑制细菌粘附，同时提高细胞活性的作用。70 nm的阳极氧化纳米管相比于光滑表面的湿润性更好，在粗糙的纳米形貌基础上进行亲水性处理可以更加明显地促进内皮细胞的生物学行为，利于血管生成因子激活从而促进种植体周围新生血管的形成[23]。通过对微米表面进行改性获得微/纳米复合结构也可以提高材料表面亲水性[24]。增加表面纳米粗糙度可以增加润湿性，从而增加表面能，但是原子层沉积的二氧化钛纳米涂层表面的发现与常规认识有所不同，成纤维细胞的粘附力与初始表面能是成反比的[25]。这种不确定性可能与表面吸附蛋白动力学与种植体其他理化特性之间的复杂作用相关。但是可以确定的是表面粗糙度/表面自由能较高的种植体表面会促进菌斑生物膜的形成[26]，高粗糙度和高表面能对于种植体的生物特性是一把双刃剑，如何合理利用这把双刃剑是值得探讨的。

3 结论与展望

纳米形貌修饰是当前钛表面设计的一个重要研究热点，现阶段对经皮肤或者穿黏膜的医疗材料研究结果汇总后认为，纳米级拓扑结构可能是促进软组织封闭的关键步骤。众所周知，细胞微环境中，基因和胞外介质共同调控细胞行为及功能，不同表面形貌会导致基因表达的差异[27]，例如在干细胞方面，表面形貌促进组蛋白第三亚基的乙酰化水平来影响细胞的功能和表观遗传特性，平行微槽所产生的各向异性可以诱导细胞对齐[28]。由于表观遗传调控机制非常复杂，且实验技术上的限制，全面揭示表观遗传机制仍是一大难题，所以后续种植体材料表面形貌对周围软组织细胞表观遗传表达模式的深层机制仍有待深究。现阶段对于种植体/软组织界面的研究以体外实验为主，而体内环境错综复杂，尤其体外实验无法模拟种植体周围纤维走行，体内实验应成为软组织探究过程中不可或缺的一个环节，种植体周围结缔组织的体内实验有待继续完善。