原位组织工程及基于细胞的治疗技术在骨再生中的应用*

张朝旭 历龙飞 张馨丹 张立群 薛佳佳

（有机无机复合材料国家重点实验室/生物医用材料北京实验室/先进弹性体材料研究中心北京化工大学，北京 100029）

1 概述

1.1 骨及骨缺损修复

骨是人体重要的结缔组织器官，由胶原纤维和纳米羟基磷灰石为主要成分构成，在人体内具有运动和组织的支持与保护，以及钙磷等营养元素和骨髓的存储等重要作用[1]。临床上，骨缺损等疾病是骨科医学中最常见的疾病之一，在治疗过程中患者常面临恢复时间久和自身正常生活受限等问题[2]，且恢复效果易受骨缺损部位活动和生活习惯等患者自身因素及医疗感染、糖尿病等疾病的影响[3]，给治疗过程增加了难度，甚至出现术后数月损伤部位仍无法愈合的现象。针对骨缺损的修复，自体或异体骨移植是临床中最常使用的治疗方法。由于免疫排斥反应低、愈合时间短，自体骨移植曾被视为治疗骨缺损的“金标准”，但因自体骨移植的供体来源受限，以及会伤害供区神经和肌肉组织，而被异体骨移植所取代。异体骨移植同样面临着疾病传播、并发症产生、免疫排斥反应及供体数量缺乏等问题[4,5]。基于上述发展现状和研究背景，借助组织工程技术进行骨缺损等疾病的治疗成为科研人员及医学工作者关注和研究的热点。

1.2 组织工程技术

组织工程技术有三大要素：种子细胞、活性因子和生物支架材料。对于种子细胞，其主要来源于成熟功能细胞和胚胎干细胞，是组织工程技术中的关键组成部分；在缺损部位，活性因子能够提供一定程度的生物活性，调节组织的发育及微环境的物质平衡，对内外物理化学刺激产生响应，调控细胞行为，促进组织修复过程；支架材料能够为种子细胞及体内修复细胞提供黏附、增殖、分化的场所，其在生物相容性方面有显著优势，对人体组织无害，能够与体内环境相适应，免疫排斥反应发生概率低[6]，其中可降解的支架材料能够在体内实现逐步降解，与缺损部位的组织再生进程相匹配[7]。

20世纪80年代，组织工程技术由乔瑟夫·韦肯逖（Joseph Vacanti）与罗伯特·兰格（Robert Langer）首次提出[8]。在1991 年，Vacanti 等[9]成功将软骨细胞与可降解生物活性支架材料相结合，实现了裸鼠体内软骨组织的修复，证实组织工程技术具备制造出与成熟动物组织结构和功能类似的组织工程支架的潜力，从而为组织工程技术的发展奠定了良好基础。从此，组织工程技术逐渐成为举足轻重的组织修复手段。

支架材料在骨组织工程领域具有重要作用[10]。借助组织工程技术植入的支架材料能够在骨缺损部位构建适合再生的微环境，为细胞的招募及增殖、分化提供支撑，并为活性因子发挥效用创造条件[11]。支架材料具有优异的生物相容性是其能够用于骨组织工程的前提，在支架本身无毒性且植入体内不产生毒性的基础上，骨组织工程支架材料还需要一定的机械强度，以更好地模拟天然骨的力学性能，并为周围组织提供一定的支撑作用。此外，支架材料的形貌也在骨组织修复中不可忽视，如具有内部孔隙结构或表面仿生结构的支架能够有效促进骨再生。在此基础上，在支架的结构中引入生物活性因子，赋予支架生物活性，能够进一步促进细胞增殖与分化，从而加速骨组织再生[12]。目前，用于制备骨组织工程支架的材料种类日渐繁多，从19 世纪初仅用于填充缺损部位的生物惰性物质发展到现在包括金属、天然与合成高分子、生物陶瓷、复合材料等多种选择的支架材料体系[13]。

1.3 原位组织工程及基于细胞的治疗技术

实现骨结构与功能再生的重要前提之一，是对骨修复相关细胞的行为进行调控，其主要通过如下两种方式实现：①通过原位组织工程技术调控内源细胞行为；②通过引入外源细胞构建骨修复的理想微环境。原位组织工程技术是指通过构筑并植入支架材料，诱导内源细胞迁移至支架表面及内部，并通过支架的结构和生物活性来调控细胞行为，进而修复受损部位。原位组织工程的特点是不需要外源细胞，通过组织工程支架材料结合生物活性因子，在移植入组织缺损部位后，对体内具有分化能力的细胞进行招募，并在缺损部位进行原位组织再生[14]。原位组织工程技术通过调控内源性细胞实现组织修复过程，可以避免外源细胞在由体外植入的过程中可能引发的污染及免疫排斥等问题，并在最大程度上模拟组织的自修复过程[15]。

基于细胞的治疗方式同样发挥重要作用。间充质干细胞来源广泛，在骨髓及脂肪等组织中广泛存在，易提取与扩增。其分化能力极强，来源于各种组织的间充质干细胞几乎都能分化为成骨细胞和终末期谱系[16]，且具有抗炎与免疫调节等能力。人诱导多功能干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞以及牙髓间充质干细胞等多种间充质干细胞都被证实能够特异性分化为成骨细胞，促进骨缺损部位的再生[17]。与原位组织工程不同，基于细胞的组织工程技术主要用于支架材料等无法为骨组织再生招募足够内源性间充质干细胞的情况，需要借助外源细胞进行修复或增加治疗效果。将细胞在体外进行培养，添加药物和/或活性因子进行处理后，再移植入体内进行骨缺损修复。在体外培养过程中，细胞可以直接在支架材料上增殖或分化一段时间后植入，也可以在二维平板中增殖或分化后与支架结合植入体内。传统的组织工程是通过体外分离和培养得到种子细胞，而后接种于支架材料上植入骨缺损部位进行骨修复，但面临细胞缺乏营养、免疫炎症反应等问题。

2 原位组织工程技术

原位组织工程技术因无外源细胞引入而规避了免疫炎症反应等问题，将与骨组织细胞外基质环境相似的支架植入体内后，在内源或外源生长因子的作用下，内源细胞向支架材料表面和内部进行迁移、增殖、分化，完成组织缺损的修复[15]。在骨原位组织再生的应用中，支架材料结合外源生长因子可以通过促进细胞迁移、成骨细胞的分化、矿化成骨过程等增强骨组织修复的效果。

2.1 支架材料独立使用以促进骨修复

骨组织工程支架材料在设计及选用时需要考虑天然骨的结构，进行仿生结构设计。支架材料需要具备良好的生物相容性，为细胞的黏附、增殖、分化等活动提供场所，并具备一定的力学强度以满足材料支撑的需求[11,18]。骨组织工程支架材料主要包括金属、聚合物、生物陶瓷、复合材料等。近年来，3D 打印[19]、静电纺丝[20-22]、电场辅助[23]等技术主要用于组织工程支架材料的制备。

骨愈合初期的炎症反应在一定程度上阻碍了骨缺损的修复进程，导致巨噬细胞的类型发生改变，延迟骨再生[24]。骨组织工程支架材料能够通过有效改善体内微环境，促进巨噬细胞表型的转变，减缓炎症的发生[12]。一项研究模仿天然细胞质外基质制备了来源于脱细胞骨膜组织的细胞外基质水凝胶，在其内部不含细胞及生长因子的情况下，该水凝胶能够有效促进巨噬细胞系Raw264.7 细胞的迁移，使M1 型巨噬细胞减少，M2型巨噬细胞增多，有助于延缓骨愈合初期的炎症，促进骨缺损部位矿化骨的形成[11]。

材料表面或内部能够为细胞提供场所而促进成骨再生的同时，部分材料在降解后能够释放有效成分（如钙元素、磷酸盐等）促进成骨矿化过程[25,26]。增强成骨再生的过程也能够有效促进骨软骨再生。例如，硅基生物陶瓷支架用于骨软骨缺损的再生时，与不含磷酸钙的生物陶瓷的对比实验证实支架材料中的磷酸钙成分及硅离子能够促进软骨下骨及骨骼再生[27]。同时，基于硅酸盐的生物陶瓷支架能够促进骨髓间充质干细胞和从软骨细胞分化而来的成骨细胞的分化、生长和成熟，提升成骨相关基因表达及矿化成骨，增强成骨细胞的胶原合成过程。

支架材料内部的孔隙结构能够提供适合细胞生长的环境，同时结合外界刺激（如光热效应等），能够为肿瘤去除以及骨缺损的修复提供协同治疗。对传统白色生物陶瓷材料进行热还原，研发出包括硅酸盐和磷酸盐在内的一系列黑色生物活性陶瓷，其内部存在大量氧空位以及结构上的缺陷，为成骨细胞及皮肤细胞的黏附、增殖、分化提供良好的环境，从而表现出显著的促骨再生效果。在近红外光照射下，材料发生光热转变进而杀死肿瘤细胞，展示出对骨肿瘤的治疗及骨再生的联合效果，拓展了传统生物陶瓷材料的应用范围[28]。

在原位组织工程的应用中，大多支架材料仅停留在体外实验阶段，但现阶段运用先进的材料制备技术已经成功制备出符合临床医学要求的支架，在临床医学范围内对患者进行治疗。一项研究借助3D打印技术，定制的3D 多孔钛支架被制备出来用于修复创伤性硬膜下血肿和脑膜瘤引起的颅骨缺损，具体为借助CT技术及计算机软件对患处进行分析获得数据以使用3D 打印技术制造钛支架，并将移植物植入患者颅骨缺损处，使用螺钉固定，最终植入物能够贴合缺损处且无死区，手术部位完全愈合，无并发症出现[29]。另一项研究同样使用定制3D 打印钛移植物对21 例颅骨缺损患者进行治疗，6～24 个月的术后随访发现所有患者均无复发性伤口问题，术后CT 表明钛移植物固定良好，颅骨形状固定良好[30]。临床上通过对支架材料形状的设计，借助计算机辅助技术对缺损部位进行分析，而后制造出符合患者病情需求、具有良好生物相容性的支架，能够有效修复骨缺损，具有临床扩大应用的良好潜力。

2.2 支架材料结合生物活性药物或生长因子促进骨修复

支架材料结合生物活性药物或生长因子是常见的组织工程修复方式。通过扩散、材料的降解、触发式的可控递送，生物活性药物或生长因子从支架中释放，并在骨缺损部位发挥效用，促进骨修复。常用的生物活性药物或生长因子主要包括骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）[31]、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）[32]、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）[33]以及间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导剂2-[(1,1-联苯)-4-基氨基甲酰]苯甲酸（kartogenin,KGN）[34]等。

生长因子的缓释能够避免生长因子浓度在体内激增，同时一些生长因子能够促进成骨再生中血管的发育和成骨细胞前体的成骨分化，加速骨修复进程。Wu等[35]通过微溶胶静电纺丝技术制备了一种加载VEGF 的仿生骨膜，实现了生长因子的缓释。在大鼠颅骨缺损模型中，该仿生骨膜能够在缺损部位形成致密的骨膜结缔组织，证实了该生长因子的缓释促进了血管生成，改善了骨膜修复过程。富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）作为一种具有高活性的自体源试剂在临床中被广泛应用于骨组织工程等领域。Cao 等[15]使用投影式光固化3D 打印技术制备了包裹PRP 的水凝胶支架，以改善血小板激活后生长因子集中释放的现象，18 周的动物实验证实该包裹PRP 的水凝胶支架能够促进巨噬细胞向有利于组织修复的方向特异性极化，有效促进了骨软骨修复。

对支架材料的层状结构进行设计，可以在支架结构中的不同部位负载两种或多种生物活性物质，开发具有多重功能的载药支架，并实现多重生物活性药物或生长因子的有序时空响应递送，实现在骨修复的不同阶段发挥相应作用。Salgado 等[16]制备了一种成骨及软骨的双重效用仿生支架，将KGN 与经过异氰基丙烯酸酯改性的β-环糊精共价结合到甲基丙烯酰改性的透明质酸中，构建成软骨支架层；将阿仑磷酸盐沉积的3D打印羟基磷灰石支架作为成骨支架层。透明质酸能够有效模拟软骨组成，并且通过控制KGN和阿仑磷酸盐的释放，共同调节间充质干细胞定向分化为骨及软骨细胞。

3 基于细胞的治疗技术

基于细胞的治疗技术主要运用干细胞极强的再生能力，在缺损部位进行增殖、分化，并诱导内源干细胞的富集、分化，从而进行骨缺损治疗[36]。当内源细胞无法满足骨缺损修复的需求时，基于细胞的治疗技术能够将外源细胞植入骨缺损部位，从而强化骨缺损修复的效果。不同的细胞类型和结合生物活性药物或生长因子等对于最终的治疗效果有极大影响。间充质干细胞来源广泛，易于提取，是再生医学中广泛运用的一种细胞。其中，骨髓间充质干细胞直接来源于骨髓且成骨分化能力强，因而成为骨组织工程中应用最为广泛的细胞，已经在临床上有所应用[37]。基于细胞的治疗技术具有多样性，目前，单独使用外源细胞、结合外源细胞与生长因子、结合外源细胞与支架材料等方法进行骨修复都展现出良好的成骨再生效果。

3.1 外源细胞促进骨修复

受患者病理性因素、年龄等影响导致的间充质干细胞数量不足，使内源细胞被支架材料招募而在骨缺损部位富集的方法受到限制，进而造成由骨折等原因引发的骨缺损部位长时间不愈合[38]。因此，外源间充质干细胞在骨修复中受到广泛关注。

在不使用任何支架和生长因子的前提下，以干细胞为基础构建植入物，作为组织再生的基础材料，使用干细胞分化的组织来模拟天然软骨结构。Wu等[39]借助生物打印的手段，使用人脂肪干细胞分化的软骨细胞制备生物墨水，提供了一种不需要支架和生物材料的新型生物打印成骨修复方法，该生物墨水仅由来源于机体的细胞质外基质和脂肪组织细胞进行构成，机械性能良好，压缩模量与天然人类软骨相当，经打印后细胞仍保持较高的生物活性。由手术废物中的自体干细胞到成骨再生，这一路径有望实现医疗层面的闭环实用，制造出具有临床适用规模和生物微观结构相似的组织替代物。

使用药物对干细胞进行诱导培养并移植在骨缺损部位能够特异性增强成骨分化的过程。人牙髓干细胞是一种具有优异的自我更新和多分支分化能力的细胞，被认为比骨髓间充质干细胞更具增殖潜能。在一种向日葵黄质衍生物的刺激下，人牙髓干细胞能够诱导前成骨细胞和成骨细胞的分化，人牙髓间充质干细胞片层置于含有该向日葵黄质衍生物的培养基中进行培养，并将干细胞片层移植到小鼠颅骨缺损中，证实经处理后的人牙髓间充质干细胞能够缩短其成骨分化的时间并促进体内成骨[40]。直接使用处理后的干细胞移植入缺损部位的方法在安全性以及便利性等方面具有突出优势。

3.2 细胞与生长因子协同作用促进骨修复

外源细胞结合生长因子可对成骨过程进行调控，将外源细胞与生长因子共同植入体内，生长因子的释放能够促进外源细胞成骨分化，改善成骨效果。Chen 等[41]将骨髓间充质干细胞与浓缩血小板生长因子相结合，制备出3D 结构。植入小鼠骨缺损模型后6 周，新生骨在骨缺损的周围以及中心出现并不断由骨缺损边缘向中心生长。加入的浓缩血小板生长因子不仅为骨髓间充质干细胞提供了3D纤维蛋白结构支撑，还能释放出VEGF，促进血管的生成。此种结合生长因子与细胞的方法为骨组织工程的开发提供了新的思路与方法。Zhao等[42]的研究中，骨髓间充质干细胞封装在水凝胶微球中，并添加生物活性生长因子BMP-2，植入体内后，骨髓间充质干细胞及BMP-2 能够有效释放，细胞在骨缺损部位进行增殖分化成为成骨细胞，并在BMP-2 的刺激下促进骨形成的过程。生长因子BMP-2 的加入为体系增加了成骨过程的活性，能够促进骨髓间充质干细胞的分化、矿物质沉积和骨组织的发育。

3.3 外源细胞与支架材料相结合促进骨修复

外源细胞结合组织工程支架已成为骨缺损修复过程中的普遍性选择。将干细胞注入动物模型中是评估细胞修复骨缺损效用常用的手段，但细胞植入后较难找到适宜的黏附与增殖分化的环境。通过组织工程技术为外源细胞构建支架材料能够有效改善这一问题，并且支架材料与细胞的联合使用具有调节炎症因子、促进成骨基因表达等功效，提升骨缺损修复的效果。

将成骨潜力强于骨髓间充质干细胞的牙龈间充质干细胞与水凝胶支架相结合能够提供力学以及界面效果，调节炎症因子的表达促进成骨再生。对海藻酸钠进行双键以及多巴胺改性，并使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspatic acid,RGD）序列多肽修饰，提升增强水凝胶的粘附性及生物相容性[43]。将牙龈间充质干细胞及羟基磷灰石装载在凝胶中，该功能水凝胶具有可降解性能与可调节力学性能，能够在缺损部位进行有效填充以在水凝胶与周围组织之间提供良好的配合与界面。动物实验证实，该种方法将牙龈间充质干细胞与水凝胶支架相结合，能够有效通过调节炎症因子的表达促进大鼠颅面骨组织的修复与重建。

外源细胞的加入和对支架结构的调控能够协同促进成骨过程。将骨髓间充质干细胞负载于海藻酸钠与生物玻璃的复合水凝胶中，水凝胶材料内部表现出分层的结构[44]。该复合水凝胶支架材料能够模拟天然骨软骨的结构，干细胞的引入能够上调成骨过程中骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原蛋白基因的表达，以此增强间充质干细胞的成骨分化，促进新生组织与宿主组织之间的整合。

尽管目前基于细胞的治疗技术多仅限于临床动物模型，也有文献报道成功在患者体内借助间充质干细胞对大面积骨缺损进行治疗。Hesse 等[45]在72 mm 严重骨缺损的患者中使用脱细胞的牛小梁骨盘接种自体骨髓间充质干细胞，并通过髓内钉进行固定，所移植的自体骨髓间充质干细胞能够有效促进手术部位血管化的生成并通过招募宿主成骨祖细胞到修复部位并分化为成骨细胞，建立支持骨再生的微环境。D'aquino等[46]使用牙髓干细胞和胶原海绵支架相结合构建生物复合物修复患者的口腔颌面。将细胞接种到胶原海绵支架后移植入患者第三磨牙拔除后的缺损部位，术后3个月患者的牙周组织已经完全恢复至第二磨牙，1年后损伤部位表现出骨完全再生的恢复效果。Hesse 等[47]将自体骨髓细胞植入脱细胞的牛骨小梁椎间盘，培养后植入患者体内，对一例58岁患者的承重长骨大阶段缺损进行了成功修复，术后6周即呈现骨再生效果，患者可负重自由行走，2年后随访证实手术成功。临床上的医学表现再次充分证实了外源细胞结合支架所具有的潜力和实际用处，也表明此种细胞与支架材料的结合将是未来临床上治疗骨缺损的有力手段之一。

将患者自体骨材料结合到组织工程支架材料中，成功为基于细胞的治疗技术治疗骨缺损拓宽了思路。由于自体骨材料中包含具有成骨再生能力的细胞，如能在支架材料的制备过程中保留骨颗粒中的细胞活力，就能为成骨再生过程提供良好的保障。Ratheesh 等[48]将患者自体骨颗粒加载到水凝胶中制备混合生物墨水，并使用3D 打印制备水凝胶支架材料。对混合生物墨水进行研究发现，自体骨材料中细胞的迁移和增殖能够通过水凝胶浓度来进行调节，且自体骨材料中细胞可以进行迁移、增殖等行为，验证了其成骨分化能力。

4 小结

目前，在骨修复领域中，原位组织工程技术和基于细胞的治疗技术均有长足的发展：支架材料方面，应用于骨组织工程技术的支架材料选择较为广泛，从金属、陶瓷、天然与合成高分子和复合材料均有所涉及。原位3D 打印、计算机辅助成像等技术也在骨组织工程领域有了越来越多的应用。基于细胞的组织工程治疗也在骨修复领域大显身手，使外源性细胞有望成为未来骨组织工程领域最有发展前景的选择。未来期待：①开发先进制造技术和制备功能更加突出、治疗效果更进一步的复合型多功能支架材料；②探究更多种类的干细胞应用于临床，以拓展骨缺损修复中种子细胞的来源与选择，并阐明干细胞在骨缺损治疗过程中分子与细胞层面的机制；③开发更多效果显著的促进干细胞成骨分化过程的生物活性药物或生长因子，并实现其多重有序可控递送，以实现时空动态调控骨修复；④对材料及外源细胞植入机体后出现免疫排斥反应的机理和修复手段进行可视化示踪研究，明确其在体内的变化规律与演变机制；⑤通过合理的材料和细胞选择及技术改进以减少骨组织工程领域临床应用中的伦理问题。