辐射损伤相关生物标志物的研究进展

成明慧 龙伟 徐文清

中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室 300192

根据美国食品和药品监督管理局（food and drug administration，FDA）的定义，生物标志物是一种可以被检测到的生化指标，可以反映特定的生理学、病理学或治疗过程，评估不同类型的生物学特性或参数[1]。因此，生物标志物对鉴定疾病表型和开发药物至关重要。生物标志物主要包括基因序列、微小RNA（microRNAs，miRNAs）、长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）、代谢物、微生物群、细胞因子和趋化因子等。目前，美国FDA 已批准了约150 种药物作用于机体后产生的生物标志物[1]，然而都与辐射不相关。多个潜在的生物标志物正在确认中，其中一些具有抗辐射应用价值。

抗辐射药物研发已有70 年的历史，虽然研究者研发了一些效果较好的药物，但可以应用于临床、效果好且不良反应小的抗辐射药物很少。例如氨磷汀，由于会使患者产生恶心和低血压等不良反应，使得临床应用受限。充分研究辐射损伤的作用机制，对于研发抗辐射药物至关重要，而辐射损伤生物标志物的研究是其中重要的一环。美国FDA明确规定，如果一种生物标志物审查合格，就可以在多个相关的药物中使用，从而加快药物的研发进程[1-2]。

除了与抗辐射药物相关的生物标志物之外，用于评估辐射吸收剂量的生物标志物也很重要。因为在发生大规模的核事故时，需要快速评估大量伤员的个人吸收剂量，并据此制定辐射救治方案。近年来，有研究者尝试用血液学、生化和细胞遗传学参数来估算辐射吸收剂量，如C 反应蛋白、淀粉酶和细胞因子，然而这些标志物个体间差异大，并且会随炎症和感染等因素波动[3]。目前，淋巴细胞耗竭分析和双着丝粒染色体分析是用于评估辐射吸收剂量的“金标准”，但是淋巴细胞耗竭分析耗费时间较长，而双着丝粒染色体分析技术含量高，劳动强度大，需要专业人员操作[4]。另外，磷酸化组蛋白H2AX（phosphorylated histone H2AX，γ-H2AX）是检测DNA 双链断裂的最佳生物标志物，然而最佳检测时间是照射后0～2 h，随后γ-H2AX 表达水平急剧下降，因此检测窗口很窄。综上，新型生物标志物应该对辐射敏感、稳定性好，并且能以非侵入性或微创性的方式进行快速和重复检测。随着代谢组学、免疫组学和基因组学应用于辐射剂量学领域，基因转录标志物（miRNAs、lncRNAs 等）、辐射代谢物和新的测量技术等丰富了辐射生物标志物的范围，我们对近年来辐射相关新型生物标志物的最新研究进展予以综述。

1 与抗辐射药物相关的潜在生物标志物

抗辐射药物在体内作用产生的生物标志物与该药物的药效相关，理想的生物标志物应从以下4 个方面考察：（1）是否与药物的作用机制相关；（2）是否与存活率相关；（3）是否可以在多个物种间观察到；（4）是否可通过相对微创性技术获得，并可进行分析量化[1]。

1.1 粒 细 胞 集 落 刺 激 因 子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）和白细胞介素6（interleukin，IL-6）

CBLB502（Entolimod）是美国FDA 授权作为治疗急性辐射综合征（acute radiation syndrome，ARS）的指定药物，并获得了新药临床试验授权[5]。G-CSF和IL-6 是CBLB502 在体内发挥辐射防护作用和缓解作用的关键细胞因子，对受到急性照射的小鼠注射G-CSF 或IL-6 中和抗体可以消除CBLB502的辐射防护作用[6]，因此G-CSF 和IL-6 可能作为潜在的生物标志物，以证明CBLB502 通过刺激机体产生G-CSF 和IL-6 而发挥抗辐射作用。另外，该结果也在小鼠、犬科动物和非人类灵长类动物（non-human primates，NHPs）模型中得到验证[7]。许多研究结果表明，给予受到60Co γ 或X 射线照射的小鼠（8～10 周龄的CD2F1 或C57BL/6J 雄鼠）多种抗辐射药物[5-雄烯二醇（5-AED）、δ-生育三烯酚（GT3）、γ-生育三烯酚（DT3）和琥珀酸生育酚（TS）]，结果发现，G-CSF 和IL-6 水平以时间依赖的方式升高[8-10]。使用G-CSF 或IL-6 抗体同样可以消除5-雄烯二醇（5-AED）、δ-生育三烯酚（GT3）、γ-生 育 三 烯 酚（DT3）和 琥 珀 酸 生 育 酚（TS）对小鼠的辐射防护作用。如果美国FDA 批准将G-CSF和IL-6 作为抗辐射相关的生物标志物，可能会加快以上多种抗辐射药物的研究进程。G-CSF 已经被美国FDA 批准用于减轻由致死剂量辐射引起的造血系统ARS[11]。期待G-CSF 可以作为与抗辐射药物相关的潜在生物标志物，为辐射损伤救治方案的制定提供参考。

1.2 瓜氨酸

瓜氨酸是小肠细胞谷氨酰胺代谢的终产物，对小肠上皮具有组织特异性，其血浆浓度与肠道组织损伤程度呈负相关。迄今为止，只有瓜氨酸被确定为辐射诱导肠道损伤和肠上皮细胞丢失的循环生物标志物[12]。Jones 等[13]连续采用IL-11 处理全身受到致死剂量X 射线照射的小鼠（8～10 周龄的C57BL/6J 雄鼠），结果发现，其血清瓜氨酸水平回升明显加快，并且小肠健康状况恢复很快，IL-11 处理组的小鼠生存率高于单纯照射组，该研究结果表明瓜氨酸或可作为潜在的生物标志物，这说明IL-11 在体内通过瓜氨酸发挥抗辐射作用。此外，经IL-11处理的小鼠30 d 存活率和肠隐窝存活率显著高于单纯照射组。肠道损伤水平与瓜氨酸之间的相关性已在小鼠实验中得到了充分验证，美国FDA 规定生物标志物应广泛存在于多个物种中。还有研究结果发现，NHPs 和哥廷根小型猪（gottingen minipig，GMP）受到致死剂量照射后，出现胃肠道ARS，同时血清瓜氨酸水平显著降低[14]。因此，这也间接论证了瓜氨酸的表达水平可以用来评估抗辐射药物的效果。

1.3 其他

除G-CSF、IL-6 和瓜氨酸之外，其他抗辐射药物的潜在生物标志物正在研究中。Basile 等[15]的研究结果发现，低剂量的HemaMax（一种重组人IL-12）可通过促进造血、免疫和胃肠功能的恢复，提高受照小鼠（C57BL/6J 雌鼠）和NHPs 的存活率，同时显著地提高了血浆中干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）的水平。进一步的研究结果发现，IFN-γ可以评估不同物种间等效药理作用对应的剂量，实现物种间剂量转换，这提示IFN-γ 可作为抗辐射药物潜在的生物标志物[15]。也有研究结果表明，用(E)-4-羧基苯乙烯基-4-氯苯甲基砜钠盐（Ex-RAD）处理受到10 Gy60Co γ 或137Cs 射线照射的细胞，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路活化，并且磷酸化的Akt（pAKT）以剂量依赖性方式增加，因此pAKT 可作为抗辐射药物潜在的生物标志物，表明(E)-4-羧基苯乙烯基-4-氯苯甲基砜钠盐具有抗辐射作用[16]。

2 用于辐射吸收剂量估算的潜在生物标志物

可靠的生物标志物对于快速准确评估辐射吸收剂量和实施有效的应对措施至关重要。然而目前还没有最佳的生物标志物来评估辐射吸收剂量。我们总结了多种用于估算辐射吸收剂量的潜在生物标志物。

2.1 肠道微生物

人和动物身上的微生物绝大多数寄生在肠道，可以随粪便排出体外。对GMP、雄性BALB/c 小鼠和NHPs 模型的研究结果表明，辐射可以引起粪便中特定肠道微生物群的丰度发生变化，这表明某些微生物对宿主全身照射很敏感，具备作为辐射生物标志物的潜力[17-18]。例如在GMP 和中国恒河猴ARS 的模型中，这些动物肠道中的微生物呈现出可预测和剂量依赖性的变化。将二者暴露于5 个不同的剂量水平下，随后对其粪便标本进行高通量测序，结果发现，普氏杆菌、乳杆菌、梭状芽孢杆菌和振荡杆菌的丰度与辐射剂量呈显著正相关（P＜0.05）。除此之外，普氏杆菌、振荡杆菌和密螺旋体与GMP 的存活率密切相关，链球菌与中国恒河猴的存活率相关，该研究结果表明，肠道微生物中的特定成员是衡量辐射吸收剂量的可靠生物标志物[16]。在另一项采用基因芯片分析Wistar 大鼠受X 射线照射后肠道微生物组成的研究中，结果发现，类杆菌科、乳杆菌科和链球菌科的12 个菌株在受到辐射后16S rRNA 水平升高，47 个单独的梭菌科菌株的16S rRNA水平下降[19]，这表明肠道微生物可用于评估辐射吸收剂量。以上潜在的生物标志物普遍存在于人和动物的粪便中，且这种基于分析肠道微生物的技术是非侵入性的，便于操作。基于以上优点，肠道微生物代表了一种新型的生物标志物，可以显著扩大辐射吸收剂量评估的范围和提高准确性。

此外，肠道微生物的代谢物质与辐射吸收剂量也有一定的相关性。C57BL/6J 小鼠受到0～8 Gy X 射线全身照射后，在肠道微生物群的代谢物质中，37 种化合物的浓度与辐射剂量相关，其中嘧啶水平与辐射剂量呈正相关，色氨酸代谢水平与辐射剂量呈负相关[20]，这表明肠道微生物群的代谢物也是潜在的估算辐射吸收剂量的生物标志物。

2.2 mRNA

mRNA 是基因表达的桥梁，mRNA 将DNA 的遗传信息传递给下游的靶标和信号通路，我们据此推测mRNA 作为生物标志物的研究是非常有前景的。人外周血淋巴细胞的辐射生物标志物在紫外线照射后24 h 出现，虽然mRNA 的水平一般随时间的推移而降低，但许多生物标志物在照射后72 h 仍显著升高[21]。低剂量（2～50 cGy）辐射可以诱导正常人淋巴细胞某些特定的mRNA 转录水平上调，其中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A 基因（CDKN1A）和生长抑制及DNA 损伤诱导基因（GADD45）的mRNA表达水平在上调的同时呈线性剂量效应关系[22]。因此，细胞基因表达的相对水平可以用来估算辐射吸收剂量。

2.3 miRNAs

miRNAs 是由18～24 个核苷酸组成的非编码RNA。由于其尺寸较小并且受外泌体保护，因此miRNAs 相对稳定。另外在同一物种的个体中，miRNAs 重现性好。基于以上2 个特性，体液中的miRNAs 可以作为很多生理反应和病理阶段的生物标志物[23]。目前对辐射生物剂量敏感的miRNAs 的研究正在进行，Dinh 等[24]的研究结果发现，小鼠（C57BL/6J 雌鼠）经1～8 Gy 单次全身照射后血清中miR-150的水平随照射剂量的增加呈依赖性降低，在随后的时间点（48 h 和72 h）或更高剂量（8～12 Gy）下同步降低。研究者又进一步研究了不同组别的小鼠接受单次或分次的相同照射剂量后，结果发现，血清中miR-150 水平的变化趋势一致，这进一步证实了miR-150 作为潜在生物标志物的敏感性和稳定性。血清中的miR-23a-3p 对辐射损伤没有反应，而进化保守的miR-150-5p 在小鼠和NHPs137Cs（110 cGy/min）全身照射模型中显示出剂量反应性[25]。因此，用miR-23a-3p 标准化miR-150-5p 的水平，可以减少个体间误差。例如最新一项基于双miRNA 法（miR150-5p/miR-23a-3p）估算电离辐射吸收剂量的研究结果显示，在照射后数小时或1 周内，仅用小鼠（6～10 周龄的C57BL/6J 小鼠）的一滴血就可以估算低剂量范围（0.5～3.5 Gy）的辐射吸收剂量，分辨率较好[26]。综上所述，基于miRNAs 的敏感性、稳定性和准确性，其在辐射事故的分诊中具有广阔的前景。

除单个的miRNAs 可以作为潜在生物标志物用来评估辐射吸收剂量外，另一项研究结果发现，特定组成的miRNAs 也具备作为生物标志物的潜力，该研究结果显示，第1 组5 个miRNAs（miR-130a-3p、miR-150-5p、miR-142-5p、miR-706 和miR-342-3p）能够区分出受到0 Gy 和2 Gy137Cs γ 射线照射（110 cGy/min）的小鼠，并且照射后7 d 仍然可以将其区分；第2 组3 个miRNAs（miR-34b-3p、miR-126-3p 和miR-17-3p）同样能够在辐射暴露后24 h 和7 d 区分低亚致死剂量和高亚致死剂量的辐射；第3 组5 个miRNAs 能够在24 h内区分6.5 Gy 和8 Gy 的照射（分别为高亚致死剂量和高致死剂量）[25]。值得注意的是，每组中没有一个单独的miRNAs 能够区分0 Gy 与2 Gy、2 Gy与6.5 Gy、6.5 Gy 与8 Gy的辐射剂量。Aryankalayil 等[27]利用小鼠（6～8 周龄的C57BL/6J 雌鼠）模型证明，血浆miRNAs 表达特征谱可以区分接受0.5、2、10 Gy X 射线全身照射的小鼠，其准确率、灵敏度和特异度都在90%以上。上述研究结果表明，基于miRNAs 变化的生物标志物或可成为有效测定生物剂量的工具。

2.4 lncRNAs

lncRNAs 是一类长度超过200 个核苷酸的类mRNA 转录物，存在于约80%的转录物中[28]。lncRNAs 会因细胞类型的不同而特异性表达，并对各种刺激作出反应。Xu 等[29]将体外培养的人支气管上皮细胞分别暴露于2、4、8 Gy X 射线中，通过微阵列筛选出115 个与辐射剂量存在线性关系的lncRNAs。虽然lncRNAs 不编码蛋白质，但是其可以在转录和翻译水平上调节基因的表达，因此，研究者进一步将115 个lncRNAs 共表达的mRNAs进行功能预测，结果发现，这些lncRNAs 会显著影响p53 信号通路。这表明lncRNAs 对于研究辐射损伤作用机制和推测辐射吸收剂量有一定的指导作用。虽然lncRNAs 保守性较差，仍然有一些lncRNAs 被鉴定为与辐射损伤和癌症相关的生物标志物[30]。Kabacik 等[31]报道了取自健康人体的T 淋巴细胞中的FAS-AS1（antisense RNA 1）lncRNAs 在照射后以剂量依赖的方式上调了5 倍。目前，由于lncRNAs 保守性差，因此只有一小部分lncRNAs被研究过，未来新技术的应用将有助于人类更深入地了解lncRNAs。

2.5 蛋白质

近年来，有研究者利用蛋白质组学和生物信息学技术手段，探索辐射作用于机体或细胞后蛋白质的表达变化及其与剂量效应和时空变化规律。在雄性CD2F1 小鼠（12～14 周龄）和GMP 等动物模型的研究结果中，血浆IL-18 和IL-18 结合蛋白（IL-18BP）的水平在γ 射线照射后第1～13 天显著增加，并且IL-18BP 水平升高的第二阶段与致死辐射剂量密切相关[32]。Ossetrova 等[33]对受到1～8.5 Gy 中子或60Co γ 射线全身照射的NHPs 的血浆蛋白进行分析，根据C 反应蛋白、血清淀粉样蛋白A（SAA）、IL-6和Flt3 配体（Flt3L）等蛋白质的不同组合建立剂量-效应校准曲线，曲线拟合性良好，因此，蛋白质生物标志物的组合比任何一个单独的生物标志物具有更高的准确性。为了得到更加贴近人体的数据，Lee 等[34]采用受到X 射线照射（88 cGy/min）的人源化小鼠识别出了46 种辐射响应蛋白，并选择了其中4 种蛋白[铁氧还蛋白还原酶（FDXR）、B 淋巴细胞瘤2 基因相关X 蛋白（BAX）、DNA 损伤特异结合蛋白2（DDB2）和肌动蛋白α1（ACTN1）]作为辐射剂量估算的候选生物标志物。然而以上蛋白质是否可以作为辐射剂量效应的生物标志物仍需进一步的研究和验证。

3 小结与展望

生物标志物对于疾病表型鉴定和药物开发至关重要。在放射生物学领域，不同的生物标志物可用于抗辐射药物的开发和评估辐射吸收剂量。在发生突发性辐射事故时，这些类型的生物标志物的效用和实施存在差异。尽管一些生物标志物已经被美国FDA 批准用于一些适应证，但对抗辐射损伤和估算辐射剂量的生物标志物的研究尚处于空白阶段。造成这种情况的原因有很多：（1）若将人体暴露在辐射下是不符合伦理的，因此我们不可能通过人体研究获得生物标志物；（2）发生辐射事故时，医疗人员将集中精力对受照者进行分类与治疗，很难及时从辐射暴露的受照者身上收集样本，并对这些样本进行生物标志物的识别和验证；（3）用动物模型确定生物标志物的过程是缓慢的，需要从小型动物模型推进到大型动物模型，再根据等效性原则推测；（4）大部分的辐射研究集中在全身照射，较少涉及局部照射和复合损伤（辐射合并烧伤或伤口）。然而实际情况下，局部身体暴露和复合损伤比全身均匀辐射暴露的发生率更高。因此，局部暴露和复合伤患者的生物标志物评价将是未来的探索方向。

针对以上问题，我们认为应扩大放射生物学研究的范围，使其成为对未来研究者更有吸引力的领域，例如引入代谢组学，可以检测辐射反应以及代谢产物的变化，这是一系列放大蛋白质组和转录组事件的结果。另外，代谢物鉴定数据库的建立为临床应用及在现实生活中实现人群筛查提供可能。近年来，在大鼠和NHPs 模型中，利用代谢组学分析完成了涉及辐射剂量和时间依赖性的研究[35]。考虑到现有的潜在生物标志物的不足，识别更好的辐射生物标志物非常重要。随着该领域合作研究和资金的增加，预计未来在关于估算辐射吸收剂量和评价抗辐射药物有效性方面的生物标志物的研究将取得快速进展。

利益冲突本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明成明慧、龙伟负责文献的查阅、综述的撰写；徐文清负责综述的指导与审阅。