肿瘤相关巨噬细胞在放疗中的研究进展

王茵 吴茜茜 刘来昱 官键

1 南方医科大学南方医院放疗科，广州 510515；2 南方医科大学南方医院呼吸与危重症医学科，广州 510515

肿瘤微环境主要由免疫细胞、成纤维细胞、血管和细胞外基质等共同构成，其在良恶性肿瘤的发生、进展和转移中发挥极为重要的作用[1-2]。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是肿瘤免疫微环境的重要组成部分，其在肿瘤组织中的占比可达50%以上。TAMs（尤其是免疫抑制表型）的浸润与大多数肿瘤的不良预后密切相关[3]，且与治疗耐药相关。放疗是实体瘤的主要治疗方法之一[4]，但患者常因肿瘤复发而预后不良。在不同的肿瘤类型和放疗模式下，放疗可对TAMs 等免疫细胞进行重编程，TAMs 重编程又进一步影响放疗的疗效，导致放疗抵抗和肿瘤复发等结局[5]。因此，探究TAMs 在放疗中的重要角色及作用机制对预测肿瘤治疗的疗效和调整治疗方案至关重要。

1 TAMs 概述

1.1 TAMs 的招募

在生理状态下，大多数组织和器官中的巨噬细胞均来源于组织驻留巨噬细胞和外周血单核细胞[6]。TAMs 同样由组织中已存在的巨噬细胞和骨髓来源的外周血单核细胞构成[7]，后者通过多种趋化因子的趋化作用进入肿瘤组织，并分化为巨噬细胞。

CC 基序趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）2 是介导单核细胞招募至肿瘤的主要趋化因子，肿瘤中CCL2 的水平与TAMs 的浸润程度显著相关[8]。肿瘤细胞和肿瘤基质细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）通路的活化及肝激酶B1（LKB1）基因的丢失均可促进CCL2 的表达，从而促进TAMs 的招募[9-10]。其他多种趋化性因子（如CCL5）及细胞因子[血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和集落刺激因子1（colony-stimulating factor-1，CSF-1）亦参与TAMs 的招募。环境因素也会影响促进TAMs招募的主要分子，如缺氧时肿瘤细胞分泌的CXC基序趋化因子配体（CXC chemokine ligand，CXCL）12 和CCL8[11]等增加，可促进TAMs 在缺氧部位的聚集。

1.2 TAMs 的极化

巨噬细胞具有高度可塑性[12]。在生理状态下，巨噬细胞可以极化为M1 型和M2 型。M1 型即经典活化的巨噬细胞，由干扰素γ 和TNF-α 诱导，参与辅助性T 细胞（helper T cell，Th）1 型免疫反应，增强细胞杀伤活性；M2 型即替代性活化的巨噬细胞，由白细胞介素（interleukin，IL）4 和IL-13 等诱导，主要诱导Th2 型免疫反应，参与组织修复，并促进慢性炎症反应。

TAMs 可在多种刺激下[如肿瘤细胞分泌的趋化因子（CCL2 和CCL5）、CSF-1 以及间质细胞分泌的IL-1 等]向M1 型或M2 型极化，从而在肿瘤的进展中发挥重要作用。一方面，TAMs 可分泌多种生长因子来刺激肿瘤细胞增殖，并产生基质金属蛋白酶和VEGF 等重塑细胞外基质，从而促进肿瘤细胞扩散并诱发肿瘤转移，同时，TAMs 可通过上调程序性细胞死亡配体（programmed cell deathligand，PD-L）1、PD-L2[8]和细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）配体等的表达水平来参与免疫抑制微环境的形成；另一方面，TAMs 也可通过Fas/FasL 凋亡相关通路介导对肿瘤细胞的杀伤作用，并通过释放TNF-α、干扰素γ、IL-1β 和NO激活Th1 和自然杀伤细胞的免疫活性。

2 放疗和TAMs 的相互作用

放疗除了能够直接杀伤肿瘤细胞外，还可以调节免疫细胞的功能及调控肿瘤的免疫应答[13]。放疗能够影响TAMs 向肿瘤的招募及其在肿瘤中的分布，并可对TAMs 进行重编程，从而影响放疗的疗效。

2.1 放疗促进TAMs 的招募

放射线照射可通过CSF-1/CSF-1 受体（CSF-1 receptor，CSF-1R）、CXCL2/CXC 基序趋化因子受体（CXC chemokine receptor，CXCR）4、CCL2/CC基序趋化因子受体（CC chemokine receptor，CCR）2 和VEGF/VEGF 受体（VEGFR）等信号通路促进TAMs 在肿瘤部位的浸润，从而影响放疗的疗效。通过引起DNA 损伤，放射线可导致埃布尔森鼠白血病病毒致癌基因同系物1（ABL1）激酶活化、入核，促进CSF-1 的转录和表达，从而招募表达CSF-1R 的TAMs；应用CSF-1R 抑制剂可改善前列腺癌同系移植小鼠皮下模型对放疗的反应[14]。立体定向消融放疗可上调肿瘤细胞的CCL2 分泌，从而促进淋巴细胞抗原6C（Ly6C）+CCR2+TAMs 在肿瘤部位的招募[15]。放射线照射可促进小鼠原位乳腺癌模型的基质细胞分泌CCL3、CCL4和CCL5，从而促进整合素CD11b+F4/80+TAMs 向照射部位浸润，而TAMs 又可以分泌CCL4，促进肿瘤细胞向照射部位迁移，从而促进转移[16]。

此外，放疗可通过破坏肿瘤血管引发其缺氧，并上调残存的肿瘤细胞或基质细胞中的缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）1 和HIF-2[17]，HIF可促进多种细胞因子和趋化因子的转录，从而招募TAMs 向肿瘤部位（尤其是缺氧部位）浸润。在接受放疗的小鼠胶质母细胞瘤异种移植模型中，肿瘤细胞以HIF 依赖的方式上调CXCL12 的分泌，从而促进CD11b+细胞（包括TAMs）在肿瘤缺氧部位的浸润[18]。肿瘤缺氧时，VEGF、内皮-单核细胞激活多肽酶Ⅱ（EMAPⅡ）、内皮素1、内皮素2、信号素3A（Sema3A）等[11]的表达均增加，参与TAMs 向肿瘤部位的招募。

2.2 放疗促进TAMs 的极化

Nowosielska 等[19]对BALB/c 及C57BL/6 小鼠模型进行10 次0.01～0.1 Gy 的全身X 射线预照射后，分别使用肉瘤细胞和肺癌细胞构建肺转移模型，结果表明，照射可通过上调巨噬细胞中的NO 水平来抑制小鼠肺转移灶的生长。而Prakash等[20]在肿瘤形成后对其行放射线照射，并检测放射线对已形成的肿瘤中TAMs 数量和表型的变化调节，发现在对大鼠胰岛素基因1 启动子（RIP1）-猴空泡病毒40 大T 抗原（Tag）5 小鼠模型（小鼠于30 周龄时形成自发性胰岛素瘤）行2 Gy γ 射线全身照射后，TAMs 向表达诱导型NO 合酶（iNOS）的M1 型极化，M1 型效应因子（如TNF-α 和干扰素γ）分泌增加，促进效应T 细胞浸润，并调控内皮型NO 合酶（eNOS）阳性的内皮细胞分泌NO 来促进血管生成，从而促进肿瘤血管正常化和抗肿瘤免疫反应。但Seifert 等[21]对KPC 胰腺癌转基因小鼠模型（小鼠于8 周龄时形成自发性胰腺导管腺癌）或胰腺种植瘤小鼠模型行12 Gy 照射后，胰腺癌细胞中CSF-1 的分泌增加，这使得TAMs 向M2 型复极化，PD-L1 表达上调，促使效应T 细胞失活，并调控T 细胞向免疫抑制表型分化。

放疗对TAMs 表型的影响主要与照射剂量相关。中等剂量（4 Gy）的照射更易使TAMs 向M1 型极化，增强其抗肿瘤免疫效果；而低剂量（<1 Gy）和高剂量（>10 Gy）的照射使得TAMs 向M2 型极化。在多组体外实验中，巨噬细胞在低剂量（0.01～1 Gy）X 射线照射下均显示出抗炎因子[转化生长因子β（TGF-β）]分泌上调和促炎因子分泌下调[22]。Crittenden 等[23]对小鼠前列腺癌模型行3 次20 Gy的X 射线照射后，M2 型TAMs 的标志物精氨酸酶1（Arg1）的表达显著上调，而M1 型TAMs 的标志物诱导型NO 合酶（iNOS）的表达下调。

3)果实淀粉系数。苹果成熟过程中淀粉含量逐渐降低，淀粉遇到碘溶液时会呈现蓝色，所以把苹果切开，将其横断面浸入配制好的碘液中30秒，观察果肉变蓝的面积和程度，可反映果实的成熟度。不同品种的苹果成熟过程中淀粉含量的变化特性不同，可以制作不同品种苹果成熟过程中淀粉变蓝的图谱，判断成熟度很方便。根据图谱，做到苹果的适时采收。

3 放疗调控TAMs 的机制

3.1 放疗直接影响TAMs 信号通路

放疗可以激活或抑制多种调控TAMs 活化的信号通路和转录因子，从而调节TAMs 的功能。照射后TAMs 的表型取决于活性氧水平、DNA 损伤水平和下游活化通路。

入射光子可促进活性氧的产生，此后，活性氧或放射线直接作用于DNA，引发DNA 损伤。一方面，共济失调毛细血管扩张突变（ATM）积聚启动DNA 修复通路，可激活转录因子核因子（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和干扰素调节因子5（IRF5），NF-κB 等转录因子参与细胞炎症反应和细胞凋亡等多种生物学过程[24]，其可通过激活TAMs 内的炎症反应通路来促进TAMs 向M1 型极化；另一方面，活性氧和DNA 损伤可引起凋亡信号调节激酶1（ASK1）磷酸化，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路激活，从而促进TAMs 向M1 型重编程。

3.2 放疗间接调控TAMs 表型

放疗可通过调控TAMs 非自主细胞反应影响其功能，这主要是通过细胞-细胞间相互作用或释放可溶性介质实现[25]。TAMs 上的Mer 受体酪氨酸激酶（MerTK）[26]和CD36[27]等凋亡受体可与放疗后凋亡肿瘤细胞上表达的“吃掉我”信号直接地或通过桥梁分子间接地结合来清除凋亡肿瘤细胞，并促进抗炎因子（如TGF-β 和IL-10）的产生，抑制促炎因子（如TNF-α、IL-1β 和IL-12）的分泌，以阻止过度的炎症反应。

而立体定向消融放疗等超分割模式可以通过促进肿瘤细胞的免疫原性死亡，诱导损伤相关模式分子高迁移率族蛋白B1[28]、ATP[29]和钙网蛋白[30]的释放，它们分别作用于巨噬细胞的Toll 样受体4（TLR4）、嘌呤能受体P2X7 和低密度脂蛋白受体相关蛋白[31]，从而通过激活NF-κB 和Nod 样受体蛋白3（NLRP3）[32]引起促炎因子（如IL-1β）的表达。肿瘤细胞释放的双链DNA 也可通过环状一磷酸鸟苷（GMP）-一磷酸腺苷（AMP）合成酶（cGAS）/干扰素基因刺激蛋白（STING）信号通路促进Ⅰ型干扰素的释放，从而增强抗肿瘤免疫反应。

4 靶向TAMs 与放疗的联合治疗

鉴于TAMs 在肿瘤进展和治疗抵抗中的重要角色，其作为肿瘤治疗中的潜在靶点受到广泛关注。针对TAMs 的治疗策略主要包括以下3 个方面：耗竭TAMs、抑制TAMs 向肿瘤部位浸润、重编程TAMs 以使其向抗肿瘤表型发展。

4.1 靶向TAMs 治疗

早期靶向TAMs 的研究方向是耗竭TAMs。曲贝替定通过靶向肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），作用于包括TAMs 在内的单核/巨噬细胞系统而不影响其他白细胞亚群[33]。然而，清除巨噬细胞存在增加感染风险和患者体重减轻等不良反应，抑制TAMs 招募和重编程TAMs 是目前更为常见的靶向TAMs 的治疗策略。

4.2 靶向TAMs 与放疗联合治疗的现状

鉴于肿瘤微环境的复杂性，单纯调控TAMs不足以完全抑制肿瘤进展。考虑到放疗可以影响TAMs 在肿瘤中的浸润和功能，将靶向TAMs 与放疗联合有望协同增强抗肿瘤免疫反应[37]。

临床前实验结果显示，应用TAMs 靶向药物可增强放疗疗效。在胶质母细胞瘤小鼠原位及皮下瘤模型中，使用CSF-1R 小分子抑制剂PLX3397可抑制放疗引起的CD11b+髓系细胞向肿瘤部位的浸润，并抑制单核细胞向促肿瘤型TAMs 分化，相比于单纯放疗，联合治疗后小鼠的中位生存期延长[38]。在胶质母细胞瘤小鼠模型中，CXCL12 抑制剂NOX-A12 可以抑制放疗后肿瘤的血管生成和肿瘤复发，其疗效优于放疗和替莫唑胺联合的治疗方案[39]。使用CCL2 中和抗体可调控胰腺导管腺癌行大剂量放疗后导致的TAMs 浸润，从而增强放疗效果[15]。

现有多项关于靶向TAMs 与放疗联合治疗的临床研究正在开展，一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验研究（临床试验注册编号：NCT01977677）结果显示，对新诊断的胶质母细胞瘤患者在标准同步放化疗的基础上加用4 周CXCR4 抑制剂普乐沙福行灌注治疗，其中位生存期明显延长[40]。然而，一项Ⅰb/Ⅱ期临床研究（临床试验注册编号：NCT01790503）结果显示，使用CSF-1R 抑制剂PLX3397 与放疗和替莫唑胺联合治疗的新诊断的胶质母细胞瘤患者的无进展生存期和总生存期未明显改善[41]。

为使患者在联合治疗中获益，仍有几个关键因素需关注和探讨（如肿瘤类型的特异性、TAMs 靶向药物相较于放疗的施药顺序以及最佳的治疗持续时间）。针对CXCL12/CXCR4 轴靶向药物普乐沙福与放疗治疗顺序的动物模型研究结果显示，在原位宫颈癌异种移植小鼠模型中，在15 次2 Gy 的X射线放疗与顺铂联合治疗后，序贯给予3 周的普乐沙福比在放疗同期给予的治疗效果更好，这种治疗顺序也能减少普乐沙福与顺铂同期使用时所增加的晚期骨髓增生障碍等不良反应[42]。

5 小结与展望

TAMs 参与调控肿瘤进展的各个方面，故靶向TAMs，削弱其促进肿瘤进展的作用，并增强其抗肿瘤功能是极有希望的肿瘤免疫治疗方案。鉴于靶向TAMs 的单一治疗显示出有限的临床获益，其与化疗、放疗及其他免疫治疗的联合治疗成为解决疗效不佳问题的关键策略。放疗作为“免疫佐剂”，与靶向TAMs 的联合治疗对于抑制肿瘤进展具有协同作用。由于放疗对TAMs 的调控方向与单次分割剂量、总剂量和照射方式等有关，故一方面需探索放疗与靶向TAMs 联合治疗的最佳治疗策略（包括先后顺序、剂量选择等），避免治疗相关的不良反应；另一方面，需关注放疗过程中TAMs的动态变化情况，尤其是不同来源TAMs 的占比变化及基因表达谱的改变，深入探索放疗诱导TAMs招募和极化的机制，为降低放疗耐药风险及探索TAMs 靶向药物的临床应用提供理论基础。

靶向TAMs 与放疗联合治疗有望成为新的肿瘤治疗策略，目前关于联合治疗的方案及分子学机制的探索将有助于提高放疗疗效，减少放疗耐药性，使肿瘤患者更好的获益。

利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明 王茵负责文献的检索、综述的撰写；吴茜茜负责综述的修订；刘来昱负责综述的审阅；官键负责命题的提出、综述的校对。